HIF-1α稳定性和降解的实时成像

HIF-1α在许多人体癌症中相较于正常组织过度表达，这是由于多种因素和通路的交互作用，反映了特定的遗传改变和细胞外刺激。我们开发了两个HIF-1α嵌合报告系统，HIF-1α/FLuc和HIF-1α(DeltaODDD)/FLuc，以研究正常（NIH3T3和HEK293）和胶质瘤（U87）细胞中HIF-1α蛋白的严格控制水平。这些报告系统为研究不同细胞系中HIF-1α的降解提供了机会，包括在培养和异种移植中。通过免疫荧光显微镜，我们观察到正常细胞和癌细胞中HIF-1α/FLuc融合蛋白的亚细胞定位模式不同；在未转导的野生型细胞中也观察到了类似差异。在不同条件下（常氧、CoCl2处理和缺氧）观察到NIH3T3和HEK293细胞中融合蛋白和HIF-1α的动态细胞质-核交换。相比之下，U87细胞显示出更持久的核定位模式，受不同生长条件的影响较小。采用蛋白降解动力学模型，我们能够区分HIF-1α/FLuc蛋白降解的两个组分，并量化HIF-1α融合蛋白的半衰期。快速清除组分（t(1/2)约为4-6分钟）在缺氧模拟的CoCl2 MG132处理和ODD结构域删除下消失，反映了氧/VHL依赖的降解途径。缓慢清除组分（t(1/2)约为200分钟）与其他未鉴定的非氧/VHL依赖的降解途径一致。总体而言，HIF-1α/FLuc稳定性的持续生物发光读数在体外和体内都将促进影响HIF-1α稳定性和积累的治疗药物的开发和验证。