Sobreproducción y preparación a gran escala de nucleotidohidrolasa de deoxiuridina trifosfato de Escherichia coli

Se ha construido un plásmido recombinante, pHW1, que dirige la sobreproducción de la enzima nucleotidohidrolasa de deoxiuridina 5'-trifosfato (dUTPasa, EC 3.6.1.23) de Escherichia coli. Se ha reclonado un fragmento de ADN de 1900 bases que porta el gen estructural de la enzima (dut) en un vector de replicación descontrolada que también porta el fuerte promotor hacia la izquierda (pL) del bacteriófago lambda. Tras el cambio de temperatura, una cepa de E. coli que porta el nuevo plásmido presenta un aumento en la actividad de dUTPasa de aproximadamente 600 veces en medio rico en comparación con bacterias de tipo salvaje. La proteína de 64 kDa correspondiente a la forma madura de la enzima alcanza el 20% del contenido total de proteínas de la célula bacteriana. Utilizando esta cepa, se ha desarrollado un procedimiento simplificado para la purificación de dUTPasa. Los pasos de purificación consisten en la extracción de las proteínas citoplasmáticas, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio aniónico y filtración en gel en FPLC. El nuevo plásmido sobreproductor y el procedimiento de purificación simplificado desarrollado harán posible purificar dUTPasa en cantidades suficientes para estudios de caracterización detallados.