Genetic engineering of Methanothermobacter marburgensis for bioplastic production

In dieser Arbeit wird eine thermophile Plattform zur Umwandlung von CO₂ in PHB etabliert, indem Methanothermobacter marburgensis genetisch so modifiziert wird, dass es einen thermostabilen PhaABC-Stoffwechselweg exprimiert, und drei Acetoacetyl-CoA-Reduktasen (PhaB) verglichen werden: Eine NADPH-abhängige PhaB aus Caldimonas thermodepolymerans (Ther), eine chimäre Variante, die so konstruiert wurde, dass sie NADH bevorzugt (Chim), und einen Kandidaten aus Caldichromatium japonicum, von dem angenommen wird, dass er NADH-abhängig ist (Jap). Das Ziel ist die Schaffung einer tragfähigen biotechnologischen Alternative für die nachhaltige und effiziente Produktion biologisch abbaubarer Kunststoffe. Enzymtests bestätigten die Cofaktorpräferenzen: PhaB(Ther) war mit NADPH hochaktiv (54,75 U mg-1), mit NADH jedoch nahezu inaktiv (0,09 U mg-1), PhaB(Jap) zeigte eine starke NADH-Aktivität (21,96 U mg-1; 8,07 U mg-1 mit NADPH), und PhaB(Chim) blieb trotz NADH-Präferenz inaktiv (0,67 U mg-1). Die Genomintegration von PhaABC und die Isolierung der Mutanten wurden durch Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion bestätigt, die auf den Verlust des Δhpt-Signatursignals und das Vorhandensein von Stoffwechselweg-Genen abzielten, wodurch stabile Stämme für die Phänotypisierung sichergestellt wurden. Unter H2/CO2 (4:1) bei 3 bar und 55 ºC zeigte die BODIPY-Färbung und Bildgebung durch Mikroskopie eine robuste intrazelluläre PHB-Akkumulation im M. m. Jap-Stamm, moderate und zellheterogene Signale in M. m. Ther sowie nur schwache Signale in M. m. Chim. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Abstimmung der PhaB-Cofaktorverwertung auf den Redoxstoffwechsel des Wirts (NADH) eine effektive thermophile PHB-Biosynthese ermöglicht, wobei sich M. m. Jap als vielversprechender Stamm für die thermophile PHA Produktion herauskristallisiert. Zwar müssen die PHB-Quantifizierung und die chemische Bestätigung mittels LC–MS noch bestätigt werden, doch positionieren diese Ergebnisse M. marburgensis als genetisch manipulierbare, thermostabile Lösung für nachhaltige Gas-zu-Kunststoff-Bioprozesse, was Anreize bietet für: (i) die Modellierung und Optimierung der Stoffwechselwege in Methanogenen; (ii) die Entwicklung neuer genetischer Werkzeuge für Methanogene; (iii) die Skalierung und die Entwicklung entprechender Bioprozesse.