Un ensayo fluorométrico para reacciones de corte de ADN caracterizadas con la endonucleasa de restricción BamHI

Los oligonucleótidos y fragmentos de ADN marcados con fluorescencia tienen un gran potencial en la investigación de ácidos nucleicos, con aplicaciones que incluyen hibridación de ADN, secuenciación automatizada de ADN, anisotropía de fluorescencia y estudios de transferencia de energía por resonancia. Las preocupaciones pasadas con el ADN marcado con fluorescencia surgieron de las interacciones entre los fluoróforos y el ADN que resultan en una fluorescencia apagada. Este fenómeno de apagado es más problemático en estudios de transferencia de energía por resonancia porque el apagado de la fluorescencia del donante podría resultar de la transferencia de energía por resonancia o de efectos no transferenciales. En el presente estudio, se caracterizó el alivio del apagado no transferencial de un oligonucleótido de 14-mer con fluoresceína 5-isotiocianato (FITC) que contiene el sitio de restricción BamHI utilizando técnicas de fluorescencia en estado estable y resuelta en el tiempo. La cadena simple marcada con FITC se ajustó mejor a una decaída triexponencial con tiempos de vida de 0.5, 2.7 y 4.2 ns. Se encontró que el componente de 4.2 ns contribuye a más del 80% de la intensidad total en estado estable. Al anidarse con una cadena complementaria no modificada, la contribución del componente de 4.2 ns se redujo significativamente, resultando en un apagado del total de la fluorescencia en un factor de dos. Razonamos que este fenómeno de apagado debería ser un proceso reversible y podría emplearse para estudiar procesos de separación de cadenas en biología molecular. Por lo tanto, se examinó el corte del sustrato marcado con fluorescencia utilizando ADNasa I y la endonucleasa de restricción BamHI. Nuestros resultados muestran que la fluorescencia apagada se recupera totalmente tras el corte (en comparación con la de la cadena simple). La extensión del corte medida por fluorescencia fue confirmada por análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Creemos que esta técnica de "desapago" de fluorescencia puede usarse para cuantificar la cinética de otros procesos de separación y corte de cadenas de ADN en biología molecular.