Identificación y caracterización de la inmunoglobulina G en sangre como un importante inhibidor de la PCR diagnóstica

RESUMEN Se identificó un importante inhibidor de la PCR diagnóstica en plasma humano y se caracterizó el mecanismo de inhibición. La sangre humana se dividió por centrifugación en capa leucocitaria, plasma, plaquetas y eritrocitos. Se encontró que todas estas fracciones sanguíneas eran altamente inhibitorias para una mezcla de PCR estandarizada que contenía la polimerasa de ADN termostable Ampli Taq Gold. Los inhibidores de PCR en plasma humano se purificaron mediante procedimientos cromatográficos y se caracterizaron mediante un proceso de eliminación, de modo que se probaron los efectos inhibitorios de las fracciones de plasma después de cada paso de purificación. El principal inhibidor en el plasma humano, según se determinó por cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio aniónico y cromatofocalización, fue la inmunoglobulina G (IgG) sobre la base del secuenciamiento de aminoácidos N-terminales y análisis electroforético del polipéptido purificado. Cuando se añadieron diferentes concentraciones de IgG de plasma purificada (PIgG) a las mezclas de PCR que contenían 11 polimerasas de ADN termostables diferentes y 1 ng de ADN de Listeria monocytogenes como ADN plantilla, la única polimerasa que resistió la inhibición fue rTth. El efecto inhibitoria se redujo cuando el PIgG se calentó a 95°C antes de ser añadido a la PCR o después de la adición de exceso de ADN no objetivo a la mezcla de PCR. Sin embargo, se encontró que calentar el PIgG junto con el ADN objetivo a 95°C bloqueaba la amplificación. La inhibición por el PIgG puede deberse a una interacción con ADN de cadena sencilla, lo que hace que el ADN objetivo no esté disponible para 10 de las polimerasas de ADN probadas. Los resultados muestran el peligro de usar ebullición como método de pretratamiento de muestras o de usar un inicio en caliente antes de la PCR. Se encontró que el efecto de la inhibición de la PCR por el plasma podría eliminarse al mezclar plasma con perlas de ADN-agarosa antes de la amplificación, mientras que se encontró que los inhibidores de PCR en plasma se unían a las perlas de ADN-agarosa.