重组酶聚合酶扩增技术用于植物诊断诊所检测菜豆金色花叶病毒属病毒的评估

背景：双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）的植物病毒常导致严重的作物损失。这些病毒已在热带和亚热带的许多地区不断出现。与许多植物病毒一样，它们往往无法被植物诊断诊所识别，这在很大程度上是因为缺乏快速且具有成本效益的检测方法。本研究评估了一种等温扩增检测技术——重组酶聚合酶扩增（RPA）检测三种菜豆金色花叶病毒属病毒的能力，以及其在植物诊断诊所中的适用性。本研究对检测中使用的DNA提取方法以及扩增子与蛋白质的分离方法进行了改进，并与RPA生产商的操作规程进行了比较。在灵敏度、下游应用、成本和速度方面，将改进后的RPA检测方法与PCR检测方法进行了比较。结果：用于检测Bean golden yellow mosaic virus、Tomato mottle virus和Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）的重组酶聚合酶扩增（RPA）检测具有特异性，仅扩增三种不同宿主物种中的靶标病毒。当模板为使用简单低成本提取方法生成的粗提物时，RPA能够检测到靶标病毒，而PCR则不能。通过几种方法均可实现RPA生成的扩增子与DNA结合蛋白的分离，这些方法均比生产商推荐的方法更快速且成本更低。使用这些改进后的RPA检测速度快于PCR，但试剂成本相近。将人工成本计入总成本时，由于RPA的操作速度远快于PCR，因此这种改进的RPA更具成本效益。当以粗提物为模板时，RPA的灵敏度与ELISA相近。与PCR相似但不同于某些其他等温反应，RPA生成的扩增子可用于下游应用（TA克隆、限制性内切核酸酶消化、直接测序）。结论：RPA可作为植物诊断诊所经济高效检测植物病毒的有效方法。它可以在一小时或更短时间内完成，试剂成本与PCR相似但人工成本更低，且具有可接受的灵敏度和特异性水平。