ラット腫瘍壊死因子-α。ラットクッパー細胞における転写およびPCR由来のcDNAに基づくin vitro翻訳後処理

ラット肝臓からのTNF-アルファをコードする708塩基対の読み枠を持つDNA断片は、ポリメラーゼ連鎖反応によってクローニングされました。この種特異的cDNAを使用して、ビオチン標識されたアンチセンス（-）RNAが転写されました。このプローブは、TNF-アルファ遺伝子活性化のノーザンブロット解析に使用されました。ラットクッパー細胞をLPSにさらすことにより、刺激後1〜2時間の間に最大に達するTNF-アルファmRNA発現の時間依存的変化が見られました。in vitro翻訳は、マイクロソームの存在下でセンス（+）RNAを用いて行われました。免疫沈降されたタンパク質のSDSゲル電気泳動により、推定モル質量がそれぞれ26および17 kDaのポリペプチドの形成が明らかとなりました。これらは、全体の読み枠によってコードされるTNF-アルファの前駆体および成熟型TNF-アルファの推定モル質量に相当します。リーダーペプチドをコードすると推定されるcDNAの配列が削除され、残りが発現プラスミドの構築に使用されました。この構造体を使用して、生物学的に活性な成熟型TNF-アルファがE. coliにおいて発現されました（培地1リットルあたり10^6単位のTNF-アルファ）。プロペプチドおよび生物学的に活性なTNF-アルファは、それぞれマウスおよびヒトTNF-アルファに対して92％および76％のホモロジーを持っています。