Isolation and Electrophysiology of Murine Sympathetic Postganglionic Neurons in the Thoracic Paravertebral Ganglia

The thoracic paravertebral sympathetic chain postganglionic neurons (tSPNs) represent the predominant sympathetic control of vascular function in the trunk and upper extremities. tSPNs cluster to form ganglia linked by an interganglionic nerve and receive multisegmental convergent and divergent synaptic input from cholinergic sympathetic preganglionic neurons of the spinal cord (Blackman and Purves, 1969; Lichtman et al., 1980). Studies in the past have focused on cervical and lumbar chain ganglia in multiple species, but few have examined the thoracic chain ganglia, whose location and diminutive size make them less conducive to experimentation. Seminal studies on the integrative properties of preganglionic axonal projections onto tSPNs were performed in guinea pig (Blackman and Purves, 1969; Lichtman et al., 1980), but as mice have become the accepted mammalian genetic model organism, there is need to reproduce and expand on these studies in this smaller model. We describe an ex vivo approach that enables electrophysiological, calcium imaging, and optogenetic assessment of convergence, divergence, and studies on pre- to postganglionic synaptic transmission, as well as whole-cell recordings from individual tSPNs. Preganglionic axonal connections from intact ventral roots and interganglionic nerves across multiple segments can be stimulated to evoke compound action potential responses in individual thoracic ganglia as recorded with suction electrodes. Chemical block of synaptic transmission differentiates spiking of preganglionic axons from synaptically-recruited tSPNs. Further dissection, including removal of the sympathetic chain, enables whole-cell patch clamp recordings from individual tSPNs for characterization of cellular and synaptic properties., [摘要]的吨horacic椎旁小号ympathetic链p ostganglionic Ñ eurons（tSPNs）表示在躯干和上肢血管功能的主要控制交感神经。tSPN 聚集形成由节间神经连接的神经节，并从脊髓的胆碱能交感神经节前神经元接收多节段会聚和发散突触输入（Blackman 和 Purves，1969 年；Lichtman等人，1980 年）。过去的研究集中在多个物种的颈椎和腰椎链神经节，但很少研究胸椎链神经节，其位置和体积小，使其不太利于 实验。在豚鼠身上进行了关于节前轴突投射到 tSPNs 的整合特性的开创性研究（Blackman 和 Purves，1969 年；Lichtman等人，1980 年），但随着小鼠成为公认的哺乳动物遗传模型生物，需要繁殖和在这个较小的模型中扩展这些研究。我们描述了一种离体方法，该方法可以实现对收敛、发散的电生理学、钙成像和光遗传学评估，以及对节前到节后突触传递的研究，以及来自单个 tSPN 的全细胞记录。可以刺激来自完整腹根和跨多个节段的节间神经的节前轴突连接，以激发单个胸神经节中的复合动作电位反应，如用抽吸电极记录的那样。突触传递的化学块将节前轴突的尖峰与突触招募的 tSPN 区分开来。进一步解剖，包括去除交感神经链，可以从单个 tSPN 中记录全细胞膜片钳，以表征细胞和突触特性。 [背景]胸交感神经节后神经元 (tSPN) 位于双侧椎旁链神经节中。包含交感神经系统最终运动输出的重要组成部分，椎旁 tSPN 通过直接支配效应组织（包括脉管系统、脂肪组织、汗腺和竖毛肌）来促进自主稳态机制（Janig，2006 年；Bartness等人， 2010）。胸交感神经节包含一个独特的基因可分离的节后神经元组组成，与更多的颈部和下胸段相比（Furlan等，2016）。它们的形态学和电生理学特性也可能与其他地方的交感神经节后神经元 (SPN) 不同（Jobling 和 Gibbins，1999）。我们对椎旁交感神经链节后神经元电生理特性的理解主要来源于对颈椎和腰椎神经节的研究（Eccles, 1935; Erulkar and Woodward, 1968; Lichtman et al. , 1979; Purves and Wigston, 1983; Cassell et al. . , 1986; Li and Horn, 2006; Bratton et al. , 2010) 使用尖锐的微电极方法进行细胞内记录（Blackman and Purves, 1969; Lichtman et al. , 1980; Jobling and Gibbins, 1999）（然而，参见 Springer等人，2015）用穿刺伤电导即涂改基本膜性能（Staley公司等人，1992;拉尔，2011;施普林格。等人，2015）。 尽管具有生理重要性，我们对椎旁神经节功能的理解主要基于在大型哺乳动物模型中进行的工作（Blackman 和 Purves，1969；Lichtman等，1980；Rubin 和 Purves，1980；Purves 和 Lichtman，1985）。小鼠模型中分子遗传方法提供的强大分子工具包并没有使对其操作特性的深入了解（Furlan等人，2016 年）。与颈椎和腰椎链神经节不同，tSPN 位于胸腔腹壁上受保护的椎旁和胸膜下位置。这使得体内电生理学研究变得困难并解释了对离体方法的需要（Blackman 和 Purves，1969；Lichtman等，1980；Rubin 和 Purves，1980）。此外，由于大部分透明的个体神经节非常小（长度 我们还开发了离体制剂，以实现 tSPN 的全细胞记录，以评估膜特性，而不受尖锐微电极产生的穿刺泄漏影响。结果显示，膜电阻率和相关的兴奋性增强了一个数量级，突触整合的内在能力和维持放电的能力更强（McKinnon等，2019）。 为了进行全细胞贴片记录，使用精细虹膜显微切割剪刀和玻璃探针（McKinnon等人，2019 年）将链条从脊柱上完全移除。使用这种方法，人们可以研究小鼠 tSPN 中的多节段神经节前作用（cp Lichtman等人，1980），包括使用 ChAT::CHR2 小鼠通过光遗传学募集神经节前胆碱能轴突（Llewellyn等人，2010）。由于有几个遗传上不同的交感神经节前神经元群（Deuchars 和 Lall，2015 年；Blum等人，2020 年），因此可以利用各种基于 cre 的驱动方法来研究由不同节前神经元引起的多节段动作。使用基于 cre 的报告基因或基因编码的 Ca 2+指标也可以捕获遗传上不同的 tSPNs 的个体或群体活动（Furlan等人，2016 年）。总之，所描述的方法使小鼠能够用于电生理学、钙成像、光遗传学和药理学的高度可访问的离体研究，用于对胸椎旁链的输入-输出关系进行细胞和电路研究。