チアミンピロリン酸と酵素の結合の性質に関する研究

要旨 チアミンピロリン酸（TPP）がいくつかの酵素に結合する様子を、各酵素をセファデックスG-25カラムを通過させて非タンパク質結合コファクターを除去した後のコファクター依存活性を測定することで明らかにした。TPPは酵母およびジモモナスのピルビン酸脱炭酸酵素、アエロバクターα-アセトラクト酸合成酵素、エシェリキアのグリオキシレートカルボリゲースに不可逆的に結合することがわかった。プロテウスピルビン酸酸化酵素、エシェリキアピルビン酸脱水素酵素、そしてミクロコッカスジアセチルカルボリゲースがゲル濾過されるとコファクターが失われた；TPPの結合はジアセチルカルボリゲースに対して最も強かった。TPPおよび二価カチオンの効率的な解明のための手順が考案された。コファクターのために再構成された酵素は、天然酵素と類似の特性を示した。酵母およびジモモナスモビリスから解明されたピルビン酸脱炭酸酵素は、TPPが存在しない場合にMg++を結合できなかった。酵母ピルビン酸脱炭酸酵素のコファクター再構成は、低濃度のTPPに対して遅いプロセスであることが示された。TPP自体は、高濃度で、追加の二価カチオンがない状態でTPP酵素を活性化し部分的に再構成することができた。ジモモナスピルビン酸脱炭酸酵素、アエロバクターα-アセトラクト酸合成酵素、エシェリキアグリオキシレートカルボリゲースは、各酵素の一部がTPPを不可逆的に結合できるため均一ではないように見える；このコファクターは、酵素の残りの部分に対して可逆的に解離する。コファクターで飽和した酵母ピルビン酸脱炭酸酵素がpH 8.0でゲルフィルタリングされると、酵素に結合したTPPの50%が酵素から解離し、残りは不可逆的に結合していた。チアゾールピロリン酸は、解明された酵母ピルビン酸脱炭酸酵素の強力な阻害剤として、酵素のコエンザイム部位に結合することによって作用する。TPPとは異なり、チアゾールピロリン酸は酵素に可逆的に結合することが示され、高濃度のTPPによって置き換え可能である。得られた結果は、酵素から解離しないコファクターに対する解離定数を計算することの妥当性に疑問を投げかける。