Identification of a Teratogenic Drug‐Protein Complex in Sera of Phenytoin‐Treated Monkeys

Summary: Whole rat embryos were cultured for 48 h on sera drawn from monkeys before and 10 h after phe‐nytoin gavage (275 mg/kg body weight). Sera from treated monkeys caused exencephaly, anophthalmia, microcephaly, and incomplete ventral curvature when used as culture media, whereas sera drawn from the same monkeys before treatment supported normal embryonic development. To identify the cause of serum teratogenicity, isolated constituents of teratogenic sera were added to nonteratogenic sera for testing by embryo culture. Serum extracts containing free phenytoin and its free metabolites were not teratogenic. Teratogenicity was found associated with serum proteins. Using polyacryl‐amide gel electrophoresis (PAGE) and an antibody that recognized phenytoin and its metabolites, we were able to demonstrate that phenytoin was bound to a protein of 80,000 daltons. Addition of this same antibody to teratogenic sera from dosed monkeys improved the development of cultured embryos and provided additional support for this complex as the proximal teratogen. Use of the antibody to follow the uptake and distribution of phenytoin in cultured embryos suggested that only the phenytoin‐protein complex (and not phenytoin itself) was able to pass through the yolk sac and reach the tissues of the embryo proper. These results suggested that a drug‐protein complex may serve to transport drugs from their site of activation in the maternal liver to the developing embryo. RÉSUMÉ Des embryons entiers de rats ont été cultivés pendant 48 heures dans du sérum prélevé chez des singes avant et 10h après gavage par la phénytoïne (275 mg/kg de poids). Les sérums de singes traités ont provoqué exencéphalie, anophtalmie, microcé‐phalie et défaut de courbure ventrale, alors que les sérums prélevés chez les mêmes singes avant traitement ont permis un développement normal de l'embryon. Afin d'identifier la cause de la tératogénicité du sérum, des constituants isolés de sérums téra‐togènes ont été ajoutés à des sérums non tératogènes et testés sur des cultures d'embryons. Les extraits sériques contenant la phénytoine libre et ses metabolites libres ne se sont pas révélés tératogènes. La tératogénicitéétait liée aux protéines sériques. L'utilisation de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide et d'un anticorps dirigé contre la phénytoine et ses metabolites a permis de montrer que la phénytoine se trouvait liée à une protéine de PM 80 000. L'adjonction de ce mëme anticorps aux sérums tératogènes prélevés chez les singes traités a permis d'améliorer le développement des embryons cultivés, ce qui renforce l'hypothèse du röle de ce complexe comme tératogène immédiat. L'anticorps a été utilisé pour suivre la fixation et la distribution de la phénytoine dans les embryons cultivés; il est apparu que seul le complexe protéine‐phénytoïne (non la phény‐toïne seule) est capable de franchir la membrane vitelline pour atteindre les tissus proprement embryonnaires. Ces résultats suggèrent qu'un complexe médicament‐protéine sert au transport des médicaments de leur site d'activation au niveau du foie maternel vers l'embryon. RESUMEN Durante 48 horas se han cultivado embriones completas de rata en suero extraído de monos antes y 10 horas después de haber administrado fenitoína por medio de sonda gástrica (275 mg/kg de peso corporal). Los sueros de los monos tratados pro‐dujeron exencefalia, anoftalmia, microcefalia y una curvatura ventral incompleta cuando se utilizaron como medios de cultivo, mientras que los sueros extraídos de los mismos monos antes del tratamiento produjeron desarrollo embrionario normal. Para identificar la causa de la teratogenicidad del suero, consti‐tuyentes aislados del suero teratogénico fueron anadidos a los sueros no teratogénicos para determinar su actividad en el cultivo del embriön. Los extractos de suero que contenian fenitoina libre y sus metabolitos libres no eran teratogénicos. Sin embargo, la teratogenicidad estaba asociada a las proteïnas séricas. Utilizando electroforesis por gel de poliacrilamida y un anti‐cuerpo que reconocïa la fenitoina y sus metabolitos, ha sido po‐sible demostrar que la fenitoina se ligaba a las protei'nas de 80.000 dallons. La incorporaciön de este mismo anticuerpo a los sueros teratogénicos de los monos medicados mejorö el desarrollo de los cultivos de embriön y proporcionö apoyo adi‐cional para considerar este complejo como el teratögeno proximal. La utilizaciön del anticuerpo para seguir la captaciön y distribuciön de la fenitoina en los cultivos de embriön sugiere que solamente el complejo proteïna‐fenitofna (y no la fenitoína en sí misrna) pasa a través del saco del óvulo y alcanza los te‐jidos del embrión propio. Estos resultados sugieren que el complejo droga‐proteína puede servir de medio de transporte de drogas desde el lugar de activación en el hígado materno al embrión en vías de desarrollo. ZUSAMMENFASSUNG Ganze Rattenembryos wurden 48 Stunden lang in Serenkultiviert, die von Affen vor und 10 Studen nach einer Phenytoin‐Gabe (275 mg/kg Körpergewicht) stammten. Die Seren von behandelten Affen verursachten eine Exenzephalie, Anoph‐thalmie, Mikrozephalie und inkomplette Ventralkrümmung während die Seren von den gleichen Affen vor Behandlung eine normale embryonale Entwicklung unterstützten. Um die Ur‐sache der Teratogenität der Seren zu erkennen, wurden isolierte Bestandteile der teratogenen Seren den nicht‐teratogenen Seren zum Test in der Embryokultur beigegeben. Serumextrakte, die freies Phenytoin und seine freien Metaboliten enthielten, waren nicht teratogen. Eine Teratogenität wurde jedoch im Zusammen‐hang mit Serumproteinen gefunden. Mit Hilfe der Polyacryla‐midgelelektrophorese und einem Antikörper, der Phenytoin und seine Metaboliten erkennt, war es möglich zu zeigen, daß das Phenytoin an ein Protein von 80.000 Dalton gebunden ist. Die Zugabe dieses Antikörpers zu teratogenen Seren von behan‐delten Affen verbesserte die Entwicklung der kultivierten Embryos und unterstützte die Annahme, daß dieser Komplex das mögliche Teratogen darstellt. Die Anwendung des Antikörpers um Aufnahme und Verteilung des Phenytoin in kultivierten Embryos zu verfolgen, erlaubt den SchluZ, daß nur der Phenytoin‐proteinkomplex und nicht das Phenytoin selbst fähig ist, den Dottersack zu durchdringen und das Gewebe des Embryo zu er‐reichen. Diese Ergebnisse legen nahe, daß ein Medikamenten‐Proteinkomplex dazu dienen könnte, um Medikamente von der Stelle ihrer Aktivierung in der mëtterlichen Leber zum sich ent‐wickelnden Embryo zu transportieren.