Detection of Phytoplasmas Associated With Kalimantan Wilt Disease of Coconut by the Polymerase Chain Reaction

Coconut is the second Indonesia’s most important social commodity after rice. There are more than 3.6 million hectares of coconut plantations in Indonesia equivalent to one third of the total world coconut area. However, the production and productivity of the coconut are very low and unstable for various reasons, including pests and diseases. Kalimantan wilt (KW) disease causes extensive damage to coconut plantation. In previous investigations, bacteria, fungi, viruses, viroids and soil-borne pathogens such as nematodes were tested, but none of them were consistently associated with the disease. The objective of this research was to detect and diagnose the phytoplasma associating with KW. Two DNA extraction methods, namely a modification of CTAB method involving grinding coconut trunk tissue in pre-warmed CTAB instead of liquid nitrogen, and a small scale DNA extraction method, were used to prepare DNA from coconut trunk tissues. Research results showed that both methods were found equally suitable for preparing DNA from coconut trunk tissues for PCR analysis. The phytoplasmas aetiology of KW has been proved by the nested PCR approach using P1/P7 and R16F2n/R16R2 primer combinations. The study has further demonstrated that the nested PCR approach can be employed to effectively detect the presence of phytoplasma both in infected and in symptomless coconut trunk tissues. Phytoplasma DNA was amplified from 95 out of 116 samples (81.9%). Based on source of samples, phytoplasma DNA was amplified from KW infected and symptomless samples, 95.1% and 67.3% respectively. This study confirmed that KW is caused by phytoplasma. Key words : Coconut, Cocos nucifera L., plant disease, Kalimantan wilt disease, phytoplasma, polymerase chain reaction, Central Kalimantan ABSTRAK Deteksi phytoplasma yang berasosiasi dengan penyakit layu Kalimantan pada kelapa dengan reaksi rantai polymerase Kelapa merupakan komoditi sosial kedua setelah padi di Indonesia dengan luasan areal lebih dari 3.6 juta ha pertanaman, ekuivalen dengan sepertiga luas kelapa dunia, hal ini menjadikan Indonesia sebagai negara produsen kelapa terluas di dunia. Sekarang ini produksi dan produktivitas kelapa sangat rendah dan tidak stabil yang disebabkan oleh berbagai alasan termasuk serangan hama dan penyakit. Penyakit layu Kalimantan telah mengakibatkan kerugian yang besar pada pertanaman kelapa. Penelitian sebelumnya untuk mengetahui penyebab penyakit dilakukan dengan menguji bakteri, cendawan, virus, viroid dan patogen tanah seperti nematoda tetapi tidak ada yang secara konsisten berasosiasi dengan penyakit layu Kalimantan. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi dan mendiagnosa phytoplasma sebagai penyebab penyakit yang berasosiasi dengan layu Kalimantan. Penelitian ini menggunakan dua metode untuk mengekstraksi DNA yaitu metode CTAB yang biasanya menggunakan nitrogen cair dimodifikasi dengan menghancurkan sampel tanaman pada CTAB yang dipanaskan, dan metode skala kecil. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kedua metode yang digunakan menghasilkan DNA yang sama baiknya untuk analisis PCR. Teknik nested PCR menggunakan kombinasi primer P1/P7 dan R16F2n/R16R2 dapat membuktikan bahwa penyebab penyakit layu Kalimantan adalah phytoplasma. Teknik ini juga secara efektif dapat mendeteksi phytoplasma dalam jaringan tanaman kelapa yang sudah terinfeksi maupun yang belum menunjukkan gejala penyakit. DNA phytoplasma dapat dideteksi pada 95 sampel dari 116 sampel (81.9%) yang dianalisis. Berdasarkan jenis sample yang diperiksa ternyata phytoplasma dapat dideteksi pada sample yang terinfeksi maupun yang belum menunjukkan gejala penyakit masing-masing 95.1% dan 67.3%. Hasil penelitian ini mengkonfirmasi bahwa penyakit layu Kalimantan disebabkan oleh phytoplasma. Kata kunci: Kelapa, Cocos nucifera L., penyakit tanaman, penyakit layu Kalimantan, phytoplasma, reaksi rantai polymerase, Kalimantan Tengah