Characterization of monoclonal antibodies against Brucella melitensis

Summary Eight specific monoclonal antibodies were isolated from fusions of myeloma cells with spleen‐cells from mice immunized with Brucella melitensis 16 M. An Enzyme‐linked immunosorbent assay was used to screen the hybridoma supernatants and to determine the cross‐reactivity of the monoclonal antibodies with other bacteria. Five monoclonal antibodies reacted with smooth and rough Brucella strains and with all gram‐negative bacteria tested. One monoclonal antibody reacted with smooth Brucella strains and with Yersinia enterocolitica 0:9, and two monoclonal antibodies were specific for smooth Brucella strains. The latter two antibodies belonged to the antibody subclasses IgG 2 a (BM/38) and IgG 1 (BM/40). Both cultures were grown in serum‐free medium and were subsequently concentrated by AMICON ultrafiltration. The protein concentrations ranged between 1 and 3.5 mg/ml, the main contamination being residues of bovine serum albumin (40—60%). Samples of the concentrated antibodies were used for peroxidase‐labelling and were found to have high titres as determined by ELISA. A double antibody sandwich ELISA with both monoclonal antibodies was devised which was highly specific for Brucella melitensis 16 M. The applicability of such a test for diagnostic purposes is discussed. Zusammenfassung Brucella melitensis 16 M wurde zur Immunisierung von Mäusen verwendet. Durch die Fusion von Lymphozyten immuner Tiere mit Myelomzellen wurden acht Zellinien etabliert, die spezifische Antikörper produzieren. Ein „Enzyme‐linked Immunsorbent Assay” (ELISA) wurde zum Nachweis der Antikörper in den Hybridoma Überständen und zum Nachweis von Kreuzreaktionen mit anderen Bakterien verwendet. Fünf monoklonale Antikörper reagierten mit glatten und rauhen Brucella sp. und mit allen untersuchten gramnegativen Bakterien. Ein monoklonaler Antikörper reagierte mit glatten Brucella sp. und mit Yersinia enterocolitica 0 : 9, während zwei monoklonale Antikörper spezifisch für glatte Brucella‐Stämme waren. Die beiden letzteren gehörten zur IgG Subklasse 2 a (BM/38) bzw. zur Subklasse 1 (BM/40). Beide Antikörper wurden in serumfreiem Kulturmedium produziert und durch Amicon Ultrafiltration konzentriert. Die Proteinkonzentrationen lagen zwischen 1 und 3.5 mg/ml. Die Hauptkontamination bestand aus Resten von fetalem Kälberserum (40—60%). Ein Teil der konzentrierten Antikörper wurde mit Peroxidase markiert. Diese Antikörper zeigten einen hohen Titer im ELISA. Mit markiertem BM/40 und nicht‐markiertem BM/38 wurde ein ELISA zum Antigennachweis etabliert. Der Test war spezifisch für Brucella melitensis 16 M. Die mögliche Anwendung einer solchen Nachweismethode für diagnostische Zwecke wird erörtert. Résumé Caractérisation d'anticorps monoclonaux contre Brucella melitensis Brucella melitensis 16 M a été utilisée pour immuniser des souris. Par la fusion de lymphocytes des animaux immunisés avec des cellules de myélome, on a établi huit lignées cellulaires qui produisaient des anticorps. Un test ELISA (Enzyme‐linked‐Immunosorbent Assay) fut utilisé pour la mise en évidence des anticorps dans les surnageants des hybridoma et pour détecter des réactions croisées avec d'autres bactéries. Cinq anticorps monoclonaux ont réagi avec des Brucella sp. «smooth» et «rough» et avec toutes les bactiries gram‐négatives examinées. Un anticorps monoclonal a réagi avec Brucella sp. «smooth» et avec Yersinia enterocolitica 0 : 9, alors que deux anticorps monoclonaux furent spécifiques pour Brucella «smooth». Ces deux derniers appartenaient aux IgG sous‐classe 2 a (BM/38) et sous‐classe 1 (BM/40). Les deux anticorps ont été produits dans un milieu de culture sans sérum et concentrés par ultracentrifugation Amicon. Les concentrations de protéines se situaient entre 1 et 3,5 mg/ml. La contamination principale provenait de restes du sérum de fœtus de veau (40—60%). Une partie des anticorps concentrés furent marquis a la peroxydase. Ces anticorps présentèrent un titre élevé à l'ELISA. Un test ELISA a été développé pour la mise en évidence de l'antigène avec BM/40 marqué et BM/ 38 non marqué. Le test fut spécifique pour Brucella melitensis 16 M. L'emploi possible d'une telle méthode pour le diagnostic est discuté. Resumen La caracterización de los anticuerpos monoclonales anti Brucella melitensis Se utilizó Brucella melitensis 16 M para inmunizar ratones. Por medio de fusión de linfocitos de animales inmunes con células de mielomas se establecieron ocho lineas celulares, las cuales producen anticuerpos específicos. Se empleó un «Enzyme‐linked Immunosorbent Assay» (ELISA) para la puesta en evidencia de anticuerpos en las fracciones sobrenadantes de hibridoma y para la puesta en evidencia de reacciones cruzadas con otras bacterias. Cinco anticuerpos monoclonales reaccionaban con Brucella sp. lisas y rugosas y con todas las bacterias gramnegativas estudiadas. Un anticuerpo monoclonal reaccionó con Brucella sp. has y con Yersinia enterocolitica 0:9, mientras que dos anticuerpos monoclonales eran específicos para estirpes Brucella lisas. Los dos últimos pertenecían a la subclase IgG 2 a (BM/38) y a la subclase 1 (BM/40), resp. Los anticuerpos fueron producidos en medio de cultivo libre de suero sanguíneo y concentrados mediante ultrafiltración Amicon. Las concentraciones proteicas se hallaban entre 1 y 3.5 mg/ml. La contaminación principal consistía en restos de suero fetal de ternero (40—60%). Una parte de los anticuerpos concentrados se marcó con peroxidasa. Estos anticuerpos mostraban un título elevado en el ELISA. Con BM/40 marcada y BM/38 sin marcar se estableció un ELISA para la puesta en evidencia de antigenos. El test era especifico para Brucella melitensis 16 M. Se delibera sobre la acción posible de este método de puesta en evidencia para fines diagnósticos.