In vitro Differentiation of Human iPSC-derived Cardiovascular Progenitor Cells (iPSC-CVPCs)

Induced pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitor cells (iPSC-CVPCs) provide an unprecedented platform for examining the molecular underpinnings of cardiac development and disease etiology, but also have great potential to play pivotal roles in the future of regenerative medicine and pharmacogenomic studies. Biobanks like iPSCORE ( Stacey et al., 2013; Panopoulos et al., 2017), which contain iPSCs generated from hundreds of genetically and ethnically diverse individuals, are an invaluable resource for conducting these studies. Here, we present an optimized, cost-effective and highly standardized protocol for large-scale derivation of human iPSC-CVPCs using small molecules and purification using metabolic selection. We have successfully applied this protocol to derive iPSC-CVPCs from 154 different iPSCORE iPSC lines obtaining large quantities of highly pure cardiac cells. An important component of our protocol is Cell confluency estimates (ccEstimate), an automated methodology for estimating the time when an iPSC monolayer will reach 80% confluency, which is optimal for initiating iPSC-CVPC derivation, and enables the protocol to be readily used across iPSC lines with different growth rates. Moreover, we showed that cellular heterogeneity across iPSC-CVPCs is due to varying proportions of two distinct cardiac cell types: cardiomyocytes (CMs) and epicardium-derived cells (EPDCs), both of which have been shown to have a critical function in heart regeneration. This protocol eliminates the need of iPSC line-to-line optimization and can be easily adapted and scaled to high-throughput studies or to generate large quantities of cells suitable for regenerative medicine applications., [摘要 ] 诱导性多能干细胞衍生的心血管祖细胞（iPSC-CVPCs）为检查心脏发育和疾病病因的分子基础提供了前所未有的平台，但在再生医学和药物基因组学的未来中也具有重要作用。像iPSCORE这样的生物库（Stacey 等，2013 ；Panopoulos 等，2017）， 其中包含由数百个遗传和种族不同的个体产生的iPSC，是进行这些研究的宝贵资源。在这里，我们为小分子大规模衍生人iPSC-CVPCs和代谢选择纯化提供了一种优化，具有成本效益和高度标准化的方案。我们已经成功地应用了该协议，从154种不同的iPSCORE iPSC品系中获得了iPSC-CVPC，从而获得了大量的高纯度心脏细胞。一个重要的我们的协议的组成部分是Ç ELL Ç onfluency 估计S（ccEstimate ），用于估计当iPSC集单层将达到80％汇合，这是用于发起的iPSC-CVPC推导最佳的时间的自动方法，并且使得协议为易于在具有不同增长率的iPSC系列中使用。此外，我们发现跨iPSC-CVPC的细胞异质性是由于两种截然不同的心脏细胞类型（心肌细胞（CMs）和心外膜衍生细胞（EPDCs））的比例不同导致的，这两种细胞在心脏再生中均具有关键作用。该协议消除了iPSC线到线优化的需要，并且可以轻松地进行调整和扩展，以进行高通量研究或生成大量适用于再生医学应用的细胞。[背景 ] 心血管疾病（心血管病）保持全球死亡的主要原因，约占30的所有死亡原因glob的％盟友。冠状动脉疾病（CAD）和心肌梗死（MI）是最常见的CVD，仅在美国，每40 s人就有心脏病发作（协会，2016; Heron，2017; WHO ，2018; Benjamin 等。，2019； D'Antonio-Chronowska 等人，2019a）。心力衰竭会导致心肌细胞死亡，并且是由于先前存在的心脏疾病（包括CAD）而发生的形态和功能变化（心脏重塑：坏死，疤痕形成，炎症，纤维化，扩张和重塑）的结果。 MI，高血压，心肌病，心肌炎和心脏瓣膜功能异常（Cohn 等，2000； Reed 等，2017）。心力衰竭通常用β受体阻滞剂，ACEI抑制剂和醛固酮拮抗剂治疗，这些药物可部分逆转心脏重塑从而改善预后（Reis Filho 等人，2015），但不会导致心脏组织再生。目前有数项正在进行的临床试验，包括ESCORT和DREAM-HF （Menasche 等人，2015和2018； Borow 等人，2019），其目的是评估移植iPSC衍生的心血管祖细胞（iPSC- CVPC）或胚胎干细胞衍生的CVPC（ESC-CVPC）作为心力衰竭的治疗方法。如再生医学所要求的那样，使用直接从患者身上获得的生物材料来产生大量iPSC-CVPC的能力将使自体移植成为可能，从而消除了免疫抑制的需要。因此，对于未来的心力衰竭治疗方法的发展，必须开发出一种健壮且具有成本效益的协议，以生成大量高质量的iPSC-CVPC，而无需为每个iPSC系列进行个性化优化。从遗传和族裔不同的个体产生的 大量iPSC-CVPCs （D'Antonio-Chronowska 等人，2019b）也可用于对心脏毒性或心律失常作用的药物进行具有成本效益的大规模测试。先前的研究（Burridge 等人，2016）和诸如CiPA Project （Blinova 等人，2017）之类的举措表明，iPSC-CVPCs可用于测试药物的心脏毒性，如果将其放大以检查衍生的大量iPSC-CVPCs无论是健康人还是疾病患者，都可以极大地提高测试新药的安全性的效率，进而降低药物开发的成本。 我们之前已经证明了使用高度标准化的协议从数百种不同种族的个体重新编程的iPSC品系中成功获得高质量iPSC-CVPC的可行性（D'Antonio-Chronowska 等，2019b）。在这项研究中，我们进行了193次分化，以从144个个体的154个iPSCORE iPSC品系中衍生出iPSC-CVPC （Panopoulos et al。，2017）。我们获得了大量高质量的细胞，具体而言，平均而言，我们从450 cm 2 培养物中获得了1.5 x 10 8 （最多6 x 10 8 ）个细胞，其中心肌肌钙蛋白T（cTnT ; TNNT2）阳性细胞的中位数为89.2％ 。重要的是，尽管先前的分化研究承认细胞异质性以及跳动的心肌细胞和非收缩性细胞类型的存在，但未解决非收缩性细胞的起源和细胞特性。我们使用单细胞RNA-seq和大量RNAs-seq对154个iPSC-CVPCs品系进行了鉴定，并确定在所有iPSC-CVPC样品中，有两种截然不同的胎儿样心肌细胞类型：心肌细胞（CMs）和心外膜衍生细胞（ EPDCs），它们以不同的比例存在。值得注意的是，已证明CM和EPDC均可促进梗死后心脏的再生（Bargehr 等，2019）。此外，我们之前的研究表明iPSC-CVPC的分子表征如何导致鉴定有助于心脏发育和心脏病理的遗传变异（Benaglio 等，2019）。 已开发出从ESC或iPSC衍生心脏细胞的方案，以模仿心脏发生过程中自然发生的过程。最初，心脏细胞是作为胚状体培养物而衍生的，首先是通过在包含20％胎牛血清的培养基中培养ESC或通过用已知增强心脏分化的几种试剂（例如二甲亚砜，视黄酸或5-氮杂2）刺激来进行自发分化。 ′-脱氧胞苷，然后手动或机械纯化跳动的心脏细胞（Maltsev 等，1993； Burridge 等，2014）。通过开发定向分化方案极大地提高了分化效率，该方案整合了重组蛋白，包括成纤维细胞生长因子2，转化生长因子β，超家族生长因子激活素A和BMP4，血管内皮生长因子和WNT抑制剂DKK-1蛋白（Schneider和Mercola，2001； Marvin 等，2001； Beqqali 等，2006； Laflamme 等，2007），并通过改变从胚状体到单层培养的细胞分化形式（Paige 等，2010； Lian）等人，2012）。通过引入小分子方案（Lian 等，2012 和2013）和化学定义的分化培养基（Burridge 等，2014），取得了进一步的进步。最后，通过利用发育中的心脏来代谢乳酸，我们和其他人能够消除所有非心脏细胞（Burridge 等，2014; D'Antonio-Chronowska 等，2019b; Tohyama 等。，2013） 。重要的是，先前的研究已经优化了分化方案，以从有限数量的iPSC或ESC系中提取心脏细胞，并且在大多数情况下使用了小型培养皿。这里，我们提出一种优化，成本有效和高度标准化协议我们在大施加到派生的iPSC-CVPCs从154基因和种族多样化人类iPSC系- 尺寸的培养瓶。我们优化了用于驱动心脏细胞分化的IWP-2的浓度，从而改善了厚的心脏合胞体和强波浪状的Beatin g的形成（视频1）（D'Antonio-Chronowska 等，2019b）。我们还证明，在使用乳酸进行iPSC-CVPC代谢纯化之前，简单地机械破坏心脏的合胞体会改善选择并改善纯净的心脏细胞（CM和EPDC）。此外，我们开发Ç ELL Ç onfluency 估计S（ccEstimate ），用于细胞汇合的估计的自动方法在单层阶段。ccEstimate 估计每个iPSC品系单层达到融合度的80％的时间点，这是启动iPSC-CVPC分化的最佳条件。因此，ccEstimate 克服了iPSC系间差异化协议标准化的一些技术问题，这些系统的增长率变化很大。衍生的iPSC-CVPC同步跳动，对多个心脏标志物呈阳性，可直接用于分子或电生理测定，如多电极阵列（MEA），也可将其冷冻保存以备将来分析。我们的优化方案使我们能够在相同的培养条件下，从154个iPSC品系中提取高质量的iPSC-CVPC样品，这些品系是由不同种族的个体产生的，而无需任何单独的优化步骤。