Substrate chain-length specificities of polyhydroxyalkanoate synthases PhaC1 and PhaC2 from Pseudomonas aeruginosa P-5

Pseudomonas aeruginosa P-5 균주는 홀수개의 탄소수를 갖는 지방산으로부터 3-hydroxyvalerate (3HV)와 medium-chain-length (MCL) 3-hydroxyalkanoates (3HAs) 단위체로 구성된 popolyhydroxyalkanoate (PHA) 공중합체를 생산하는 특이한 성질을 갖고 있다. 이 균주가 갖고 있는 2개의 MCL-PHA synthases ( PhaC1P-5 와 PhaC2P-5 )의 탄소길이에 따른 기질특이성을 비교하기 위하여 각각의 유전자를 PHA 생합성능이 결여된 돌연변이주 Pseudomonas putida GPp104에 도입하고 발현시킨 결과, PhaC2P-5 는 3HV와 MCL 3HAs로 이루어진 공중합체를 생산하지만 PhaC1P-5 는 단지 MCL 3HAs로 구성된 공중합체를 생산하였다. 이는 PhaC2P-5 가 PhaC1P-5 과는 달리 보다 짧은 탄소길이의 3-hydroxyvaleryl Co-A를 기질로 인지하여 합성반응에 이용할 수 있음을 보여주는 것이다. 또한 PhaC2P-5 의 효소활성 및 기질특이성의 변화를 유도하기 위하여 위치지정 돌연변이생성을 수행하고 P. putida GPp104과 다른 PHA 생합성능 결여 돌연변이주인 Ralstonia eutropha PHB⁻4 에서 발현시킨 결과, PhaC2P-5 내 두 개 아미노산의 치환(Ser326Thr과 Gln482Lys)이 공중합체의 3HV 함량을 크게 증진시키는 효과를 보였다. 두 개 아미노산이 모두 치환된 PhaC2P-5 유전자( phaC2P-5QKST )를 갖는 P. putida GPp104를 nonanoic acid가 탄소원으로 함유된 배지에서 배양하였을 때, 모균주에 비해 공중합체 함량과 공중합체 내 3HV 함량이 각각 2.5배 및 3.5배 증가하였다. 따라서 phaC2P-5QKST 를 포함하는 재조합 균주는 개량된 물성의 신규PHAs 생산에 유용할 것으로 기대된다. Pseudomonas aeruginosa P-5 is an unusual organism capable of synthesizing polyhydroxyalkanoates (PHAs) consisting of 3-hydroxyvalerate (3HV) and medium-chain-length (MCL) 3-hydroxyalkanoate (3HA) monomer units when C-odd alkanoic acids are fed as the sole carbon source. Evaluation of the substrate chain-length specificity of two P. aeruginosa P-5 PHA synthases ( PhaC1P-5 and PhaC2P-5 ) by heterologous expression of PhaC1P-5 and PhaC2P-5 genes in Pseudomonas putida GPp104 revealed that PhaC2P-5 incorporates both 3HV and MCL 3HAs into PHA, whereas PhaC1P-5 favors only MCL 3HAs for polymerization. In order to obtain PhaC2P-5 mutants with altered substrate specificity, site-specific mutagenesis for PhaC2P-5 was conducted. Amino acid substitutions of PhaC2P-5 at two positions (Ser326Thr and Gln482Lys) were very effective for synthesizing copolymers with a higher 3HV fraction. When recombinant P. putida GPp104 harboring double mutated phaC2P-5 gene ( phaC2P-5QKST ) was grown on nonanoic acid, 2.5-fold increase of copolymer content with 3.8-fold increase of 3HV fraction was observed. The phaC2P-5QKST -containing Ralstonia eutropha PHB-4 supplemented with valeric acid also produced copolymers consisting of 3HV and 3-hydroxyheptanoate with a high 3HV fraction. These results suggest that recombinants containing phaC2P-5QKST could be useful for production of new PHA copolymers with improved material properties.