The discovery and study of subgenomic RNA of potato virus X

Η Вирусы и клетка УДК 578.863.1 ВЫЯВЛЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СУБГЕНОМНОЙ РНК Х-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ Д. П. Грама, Η. Η. Машковский Введение.Х-вирус картофеля (ХВК) содержит одну полицистронную РНК с молекулярной массой 2,2-10 6 , которая в бесклеточной белоксинтезирующей системе транслируется в белки 180 000 и 145 000.Эти белки содержат общую аминокислотную последовательность [1], и синтез их, по-видимому, происходит с помощью механизма, аналогичного таковому синтеза высокомолекулярных белков ВТМ и вируса желтой мозаики турнепса (ВЖМТ) [2, 3].Поскольку среди продуктов трансляции РНК ХВК белок оболочки отсутствует [1], можно предположить, что реализация генетической информации, необходимой для синтеза белка оболочки, происходит путем синтеза вирусспецифической, субгеномной РНК.Расположение гена белка оболочки возле З'-конца РНК ХВК [4], наличие низкомолекулярных ((0,53-0,3) • 10 6 ) РНК в полисомах инфицированных ХВК растений, выделенных методом иммунопреципитации с использованием антисыворотки к белку ХВК [5, 6], также указывают на возможность синтеза субгеномной РНК ХВК.Однако только прямое выявление и иммунологическое тестирование продуктов трансляции такой РНК могут служить окончательным доказательством ее существования.Для выявления субгеномной РНК в инфицированных ХВК растениях мы использовали метод блот-гибридизации, который позволяет обнаружить до Ю -5 % РНК [7], и результаты этих исследований изложены в данном сообщении.Материалы и методы.Очистка ХВК и выделение вирусной РНК.ХВК размножали в растениях дурмана и вирус очищали, как описано ранее [8].ХВК (5 мг/мл) суспендировали в буферном растворе (50 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ Na 2 ЭДТА), содержащем 100 мкг/мл бентонита, приготовленного по методу [9], и дважды экстрагировали при 4°С детергентно-фенольной смесью (1 %-ный саркозил -80 %-ный раствор фенола, содержащий 0,1 % оксихинолина и 1 % 2-меркаптоэтанола).РНК трижды переосаждали этиловым спиртом в присутствии 0,2 Μ К т а-ацетата, рН 5,0, и хранили при -20 °С под этанолом.Выделение РНК из здоровых и инфицированных растений дурмана.3-й и 4-й листы растений дурмана заражали ХВК (концентрация 0,5 мг/мл) и через 2, 3, 4, 5, б, 7 дней после заражения из них выделяли общую РНК, как описано в работе [10].Из верхних, системно инфицированных листьев, общую РНК выделяли через 6, 7, 8 дней после заражения.РНК осаждали этиловым спиртом в присутствии 0,2 Μ Na-ацетата, рН 5,0, осадок ресуспендировали и односпиральную РНК осаждали 2 Μ LiCl при -10 °С в течение ночи.LiCl-нерастворимую РНК промывали 2 Μ LiCl и хранили при -20 °С под спиртом.Приготовление композиционной смеси и выделение из нее РНК.Композиционную смесь ХВК и листьев здоровых растений готовили путем смешивания 1 мг очищенного вируса в 0,05 Μ трис-HCl, рН 7,0 и 1 г листьев здоровых растений.РНК выделяли двумя методами:1) композиционную смесь растирали в