Funktionale Expression von humanem Cathepsin S in Saccharomyces cerevisiae. Reinigung und Charakterisierung des rekombinanten Enzyms.

Ein cDNA, das das humane lysosomale Cystein-Protease-Vorläufer-Protein Cathepsin S kodiert, wurde in Hefe unter Verwendung des pVT100-U Expressionsvektors, der den Alpha-Faktor-Promotor enthält, exprimiert. Das Procathepsin S-Gen wurde entweder als Fusionsprotein mit der Präregion oder mit der Präproregion des Alpha-Faktor-Vorläufergens der Hefe exprimiert. Nach der in vitro Verarbeitung ergaben beide Konstrukte ein identisches aktives reifes Enzym mit einem Molekulargewicht von 24.000. Nach längerer Kultivierung der Zellen wird das rekombinante Protein auch als aktive Protease im Kulturüberstand gefunden. Der Vorläufer kann in vitro bei pH 4,5 und 40 Grad C unter reduzierenden Bedingungen aktiviert werden. Das in vitro aktivierte Enzym hat eine 6-Aminosäure lange NH2-terminale Erweiterung im Vergleich zum nativen bovinen Enzym. Das reinige Enzym zeigt ein umbelliformes pH-Aktivitätsprofil mit einem pH-Optimum von 6,5 und pK-Werten von 4,5 und 7,8. Der isoelektrische Punkt des rekombinanten humanen Cathepsin S liegt zwischen 8,3 und 8,6 und ist etwa 1,5 pH-Einheiten höher als beim bovinen Enzym. Die kinetischen Daten für mehrere synthetische Substrate und Inhibitoren zeigen eine Präferenz für kleinere Aminosäurereste in den Bindungsunterseiten S2 und S3 von Cathepsin S. Wie das bovine Enzym zeichnet sich das rekombinante humane Cathepsin S durch einen breiteren Bereich von pH-Stabilität (pH 5-7,5) aus als Cathepsine B und L.