Définition de la région régulatrice amino-terminale humaine du raf par mutagenèse par délétion.

L'activation du potentiel transformant du gène raf cellulaire a uniformément été associée à la délétion des séquences codantes amino-terminales. Afin de déterminer si la troncature 5' seule pouvait activer le raf cellulaire, nous avons construit 21 cDNAs humains c-raf-1 avec des délétions variables générées par BAL 31, distales à un répéteur terminal long du virus sarcomateux murin de Moloney et une séquence d'initiation de traduction consensus. Les délétions allaient de 136 à 1 399 nucléotides de séquence codante et raccourcissaient la protéine raf de 648 acides aminés de 44 à 465 acides aminés. Le cDNA c-raf-1 plein longueur n'était pas transformant après transfection des cellules NIH 3T3, tout comme quatre mutants avec des délétions de 142 acides aminés ou moins. Sept des neuf mutants avec des délétions de 154 à 273 acides aminés ont induit une transformation avec des efficacités allant de 0,25 à 70 foyers par microgramme d'ADN. Les mutants avec des délétions de 303 à 324 acides aminés ont affiché des activités transformantes élevées (comparables à celle de v-raf), avec une activité maximale de 2 400 foyers par microgramme d'ADN lorsque 305 acides aminés étaient supprimés. Des délétions supérieures à 383 acides aminés, s'étendant dans le domaine kinase du raf, n'ont pas présenté d'activité transformante. Des analyses par Northern (ARN) blotting et des essais d'immunoprécipitation ont indiqué que les cellules NIH transfectées exprimaient des ARN et des protéines raf de tailles attendues. Ainsi, la troncature 5' seule peut activer le potentiel transformant du raf, avec un pic d'activation autour de l'acide aminé 300. L'analyse de trois gènes raf précédemment détectés par transfection d'ADN tumoral a indiqué que ces gènes étaient activés par recombinaison dans l'intron 7 du raf et codés pour des protéines de fusion contenant des séquences non-raf amino-terminales. L'étendue de la délétion des séquences raf dans ces gènes recombinants correspondait à des mutants BAL 31 qui n'affichaient pas d'activité transformante élevée, suggérant que les séquences codantes non-raf fusionnées pourraient également contribuer à l'activité biologique.