Oligonukleotide mit fluoreszierenden Farbstoffen an gegenüberliegenden Enden bieten ein gequenchedes Sondensystem, das nützlich ist zum Nachweis von PCR-Produkten und der Hybridisierung von Nukleinsäuren.

Der 5'-Nuklease-PCR-Test detektiert die Akkumulation spezifischer PCR-Produkte durch Hybridisierung und Spaltung einer doppelt markierten fluorogenen Sonde während der Amplifikationsreaktion. Die Sonde ist ein Oligonukleotid mit sowohl einem reportenden fluoreszierenden Farbstoff als auch einem Quencher-Farbstoff. Eine Zunahme der Reporter-Fluoreszenzintensität zeigt an, dass die Sonde an das Ziel-PCR-Produkt hybridisiert und durch die 5'-->3' nukleolytische Aktivität der Taq-DNA-Polymerase gespalten wurde. In dieser Studie wurden Sonden mit dem Quencher-Farbstoff an einem internen Nukleotid mit Sonden verglichen, bei denen der Quencher-Farbstoff am 3'-Ende des Nukleotids angehängt war. In allen Fällen war der Reporter-Farbstoff am 5'-Ende befestigt. Alle intakten Sonden zeigten eine Dämpfung der Reporter-Fluoreszenz. Im Allgemeinen zeigten Sonden mit dem Quencher-Farbstoff am 3'-Endnukleotid ein größeres Signal im 5'-Nuklease-PCR-Test als die intern markierten Sonden. Es wird vorgeschlagen, dass das größere Signal durch eine erhöhte Wahrscheinlichkeit der Spaltung durch Taq-DNA-Polymerase verursacht wird, wenn die Sonde während der PCR an einen Matrizenstrang hybridisiert ist. Sonden mit dem Quencher-Farbstoff am 3'-Endnukleotid zeigten auch eine Zunahme der Reporter-Fluoreszenzintensität bei Hybridisierung an einen komplementären Strang. Deshalb können Oligonukleotide mit Reportern und Quenchern an gegenüberliegenden Enden als homogene Hybridisierungssonden verwendet werden.