Scanning der totalen internen Reflexionsfluoreszenzmikroskopie unter Einphoton- und Zweiphotonanregung: Bildbildung

Wir schlagen eine neue Art der totalen internen Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) vor, die als scannende TIRFM (STIRFM) bezeichnet wird und eine fokussierte Ringstrahlbeleuchtung sowie ein Hochnumerisches Apertur-Objektiv (NA = 1,65) verwendet. Das evaneszente Feld, das von der STIRFM erzeugt wird, wird seitlich fokussiert und erzeugt ein kleines Anregungsvolumen, das einen nichtlinearen Effekt wie die Zweiphotonenabsorption hervorrufen kann. Experimentelle Bilder von CdSe-Quantennpunkt-Nanokristallen und mit Rhodamin 6G dotierten Mikrokugeln zeigen, dass mit der aktuellen Anordnung gute laterale und axiale Auflösungen erreicht werden. Die theoretische Simulation des Fokalpunkts, der in der STIRFM-Geometrie erzeugt wird, zeigt, dass das fokussierte evaneszente Feld aufgrund des Depolarisationseffekts eines Hochnumerischen Apertur-Objektivs in zwei Spitzen aufgeteilt wird. Die Analyse der Punktspreizfunktion sowohl für Einphoton- als auch für Zweiphotonanregungsfälle zeigt jedoch, dass die Erkennung des Fokussplitting-Effekts von der Größe des Detektionspinholes abhängt. Der Einfluss der Pinhole-Größe auf die Bildbildung wird theoretisch untersucht und experimentell mit den Nanokristallbildern bestätigt.