Ein PKA-Aktivitätssensor zur quantitativen Analyse der endogenen GPCR-Signalgebung über 2-Photonen-FRET-FLIM- imaging

Neuromodulatoren haben tiefgreifende Auswirkungen auf das Verhalten, aber die Dynamik ihrer intrazellulären Effektoren bleibt unklar. Die meisten Neuromodulatoren exerzieren ihre Funktion über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). Eine große Herausforderung zum Verständnis der Wirkung von Neuromodulatoren ist das Fehlen dynamischer Auslesungen der biochemischen Signale, die durch die Aktivierung von GPCRs erzeugt werden. Das Adenylatcyclase/cyclic AMP/protein kinase A (PKA)-Modul ist ein zentrales Element dieser biochemischen Signalübertragung. Dieses Modul wird von mehreren verhaltensrelevanten Neuromodulatorrezeptoren reguliert. Darüber hinaus ist die PKA-Aktivität notwendig für die Induktion vieler Formen der synaptischen Plastizität sowie für die Bildung von Langzeitgedächtnis. Um die PKA-Aktivität im Gehirngewebe zu überwachen, haben wir einen 2-Photonen-Fluoreszenzlebensdauer-Imaging-Mikroskopie (2pFLIM) kompatiblen PKA-Sensor entwickelt, der FLIM-AKAR genannt wird und auf dem ratiometrischen FRET-Sensor AKAR3 basiert. FLIM-AKAR zeigt einen großen dynamischen Bereich und geringe pH-Sensitivität. Darüber hinaus ist es ein schnell diffundierendes zytoplasmatisches Protein, das spezifisch die Nettogesamtaktivität von PKA in situ berichtet. FLIM-AKAR wird robust in verschiedenen Hirnregionen mit mehreren Transfektionsmethoden exprimiert, kann auf genetisch identifizierte Zelltypen ausgerichtet werden und reagiert auf die Aktivierung sowohl endogener GPCRs als auch auf raum-zeitlich spezifische Abgabe von Glutamat. Erste Experimente zeigen eine unterschiedliche Regulation der PKA-Aktivität über subzelluläre Kompartimente als Reaktion auf Neuromodulator-Eingaben. Daher ermöglicht der Reporter FLIM-AKAR, gekoppelt mit 2pFLIM, das Studium der PKA-Aktivität als Reaktion auf Neuromodulator-Eingaben in genetisch identifizierten Neuronen im Gehirn und wirft Licht auf die intrazelluläre Dynamik der endogenen GPCR-Aktivierung.