Nachweis von cleaved Caspase-3 in apoptotischen Zellen mittels Durchflusszytometrie

Apoptose wird von Caspasen orchestriert, einer Familie von Cysteinproteasen, die ihre Substrate an der carboxyterminalen Seite spezifischer Asparaginsäurereste spalten. Diese Proteasen sind allgemein in gesunden Zellen als inaktive Zymogene vorhanden, werden jedoch bei Stimulation autolytisch gespalten, um voll aktiv zu werden. Anschließend spalten sie ihre Substrate an ein oder zwei spezifischen Stellen, was zur Aktivierung, Inaktivierung, Re-Lokalisierung oder Umgestaltung des Substrats führen kann. Folglich bleiben viele der gespaltenen Fragmente während der Apoptose intakt und können mit substratspezifischen Antikörpern nachgewiesen werden. Diese Fragmente werden am häufigsten durch Western Blotting nachgewiesen, das Proteine und ihre Fragmente basierend auf der molekularen Masse auftrennt. Dennoch können Antikörper, die nur cleaved Fragmente erkennen, verwendet werden, um spezifisch Zellen zu kennzeichnen, in denen eine Caspasenspalting stattgefunden hat. Es ist dann möglich, diese Zellen durch Durchflusszytometrie zu quantifizieren. Eine Reihe von Antikörpern, die spezifisch cleaved Fragmente erkennen, wurde erzeugt, darunter Antikörper, die die gespaltene Form von Caspase-3 erkennen. Diese Caspase ist für den Großteil der Proteolyse während der Apoptose verantwortlich, und der Nachweis von cleaved Caspase-3 wird daher als zuverlässiger Marker für Zellen angesehen, die sterben oder durch Apoptose gestorben sind. Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung der Apoptose durch die durchflusszytometrische Erkennung von cleaved Caspase-3.