Optimiertes Klonierungsprotokoll zur Erstellung von Standardskurven in qPCR von Umweltfunktionalen Genen v1

Aufgrund der komplexen und vielfältigen biochemischen Anforderungen und physiologischen Verhaltensweisen bestimmter umweltbedingter Bakterien- und Archaeen-Gruppen, die spezifische funktionale Gene als potenzielle Biomarker tragen, ist es herausfordernd, reine Kulturen dieser Organismen zu extrahieren und aufrechtzuerhalten. Daher erfordert die Erstellung von Standardskurven für qPCR das Klonen von Gensequenzen aus umweltner DNA-Proben. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Zielgene aus Umweltproben zu klonen, um plasmid DNA zu erzeugen, die dann zur Vorbereitung von Standardskurven zur Quantifizierung funktionaler Gene, einschließlich mcrA, pmoA, amoA und nosZ aus Wasser- und Bodenproben, verwendet wurde. Das Verfahren umfasst das Einfügen amplifizierter Gensequenzen in pGEM‱-T Vektoren und deren Transformation in kompetente JM104 E. coli-Zellen. Das Testen dieses Protokolls ergab höhere Mengen an reiner plasmid DNA, was es für die Vorbereitung von Standardskurven für qPCR der Zielgene geeignet macht.