Estabilização da desidrogenase de formiato dependente de NAD da Candida boidinii por mutagênese dirigida ao sítio de resíduos de cisteína

O gene da desidrogenase de formiato dependente de NAD (FDH) da levedura Candida boidinii foi clonado por PCR usando DNA genômico como molde. A expressão do gene em Escherichia coli resultou em FDH funcional com cerca de 20% da proteína solúvel da célula. Para confirmar a hipótese de um processo de desativação acoplado a tiol, ambos os resíduos de cisteína na estrutura primária da enzima foram trocados por mutagênese dirigida ao sítio usando um modelo de homologia baseado na estrutura 3D da FDH de Pseudomonas sp. 101 e de desidrogenases relacionadas. Comparado à enzima wt, a maioria dos mutantes foi significativamente mais estável em relação ao estresse oxidativo na presença de íons Cu(II), enquanto os ótimos de temperatura e as constantes cinéticas da reação enzimática não são alterados significativamente pelas mutações. A determinação dos valores de Tm revelou que a estabilidade em temperaturas acima de 50 graus C é ótima para a enzima nativa e a enzima recombinante wt (Tm 57 graus C), enquanto os valores de Tm das enzimas mutantes variam na faixa de 44-52 graus C. Os melhores resultados em testes iniciais sobre a aplicação da enzima para regeneração de NADH na biotransformação de piruvato trimetílico em L-tert-leucina foram obtidos com dois mutantes, FDHC23S e FDHC23S/C262A, que são significativamente mais estáveis do que a enzima wt.