优化荧光激活蛋白标签用于S. cerevisiae中的定量蛋白运输和共定位研究

在活细胞中对荧光蛋白进行空间和时间跟踪可以实现对蛋白组在外部信号刺激下重塑的可视化。历史上，蛋白质在运输过程中的动态变化是通过与感兴趣的蛋白质融合的持续活性荧光蛋白（FPs）进行可视化的。尽管这种方法很强大，但这些FP会标记蛋白质的所有细胞群体，可能掩盖特定亚群体的动态。为帮助研究蛋白质亚群体，开发了包括荧光激活蛋白（FAPs）在内的生物偶联标签。FAP由两个组分组成：与目标蛋白质融合的单链抗体（SCA）和马来绿（MG）衍生物，后者仅在与SCA结合时发光。重要的是，MG衍生物可以是细胞可渗透或不可渗透，从而允许在细胞表面对SCA标记的蛋白质进行独立检测，并便利定量内吞测量。为了扩展FAP在酵母中的应用，我们优化了用于酵母表达的SCA，创建了FAP标记质粒，并生成了FAP标记的细胞器标记物。为了展示FAP的有效性，我们将SCA与酵母G蛋白偶联受体Ste3结合。我们测量了Ste3对信息素的内吞动态，并表征了Ste3的顺式和反式调节因子。我们的工作显著扩展了FAP技术在S. cerevisiae中多种应用的可能性。