利用多拷贝特异性序列和 RPA-LFD 技术建立简便且可视化的马铃薯晚疫病检测方法

由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的马铃薯晚疫病是危害全球马铃薯生产的最具破坏性的病害之一。快速准确地检测该病原体对于病害的有效防控至关重要。本研究通过生物信息学分析，鉴定出一种新型的多拷贝特异性 DNA 序列，命名为 SSPI1（Specific Sequence of Phytophthora infestans 1）。以7种近缘疫霉菌和另外2种常见马铃薯病原体为对照，PCR 检测表明 SSPI1 相比 PiYPT1 具有更高的灵敏度，相比 PiITS 具有更高的特异性。基于这一新型多拷贝序列，我们将重组酶聚合酶扩增（RPA）与侧流层析试纸条（LFD）技术相结合，开发了一种快速、简便且高灵敏度的马铃薯晚疫病检测方法。整个诊断过程——包括粗 DNA 提取、RPA 扩增和目测检测——可在 35 min 内完成，无需专业设备。优化结果表明，在9对候选 RPA 引物对中，RPA-F1/RPA-R2 表现出最高的扩增效率。确定的 RPA 最佳反应温度范围为 27-42°C，对 SSPI1 的检测限为 11 copies/μl。该方法最低可检测到 100 pg 的基因组 DNA，在接种后仅 24 h 即可检出样品，甚至能检测出田间条件下无症状叶片的感染，与靶向 PiYPT1 的 RPA-LFD 检测相比表现出更高的灵敏度。总体而言，本研究为马铃薯晚疫病的早期快速检测提供了一种高灵敏度、特异、实用且高效的工具。