对Francisella novicida U112的V-A型CRISPR-Cas系统间隔子获取的洞察

CRISPR-Cas系统通过CRISPR适应过程使原核细胞产生免疫，该过程包括从外源元素获取并整合短DNA片段到CRISPR阵列中。在此，我们研究了Francisella novicida U112的V-A型CRISPR-Cas系统的间隔子获取机制。我们在体外表征了Cas1-Cas2整合酶，并阐明了预间隔子和CRISPR阵列的序列要求，以实现最佳的间隔子整合。我们证明了Cas2在其活性位点上协调金属，以促进全位点间隔子的整合。此外，我们将这一间隔子获取系统引入大肠杆菌细胞，并观察到，在体内，所有Cas蛋白对于高效的V-A型适应都是必需的，Cas12显著提高了适应效率。我们显示，间隔子主要来自编码cas基因的质粒，以及前噬菌体的基因组区域和复制起始点。此外，我们发现Cas4对单链DNA具有3'-5'外切酶活性，并对双链DNA具有ATP独立的解链活性。Cas4与Cas1-Cas2复合体相互作用，并以PAM依赖方式处理预间隔子。Cas4在体内的存在确保新间隔子来自5'-TTTN-3' PAM下游的DNA，这是靶向入侵者的关键所在.