黄嘌呤脱氢酶和黄嘌呤氧化酶的蛋白质结构差异通过与黄素活性位点探针的重组揭示

通过与CaCl2的孵育，从鸡肝黄嘌呤脱氢酶和牛奶黄嘌呤氧化酶中去除了天然黄素FAD。去黄素酶仍然保留其钼黄素和铁硫辅基，并与一系列含有化学反应性或环境敏感取代基的FAD衍生物在异黄素哌啶环系统中重组。这些含有人工黄素的重组酶都具有催化活性。无论是鸡肝脱氢酶还是牛奶氧化酶，黄素的8位都发现可以自由接触溶剂。黄素的6位在牛奶黄嘌呤氧化酶中也可以自由接触溶剂，但在鸡肝脱氢酶中相对于溶剂的暴露显著减少。通过重组的两种酶的光谱性质表明，结合的黄素周围的蛋白质结构存在明显差异，特别是在6或8位带有可电离的-OH或-SH取代基的黄素。牛奶黄嘌呤氧化酶对中性黄素或阴离子黄素（8-OH-FAD）的结合无明显偏好，或对阴离子形式的黄素（6-羟基-FAD、6-巯基-FAD，可能还有8-巯基-FAD）有轻微偏好。另一方面，鸡肝脱氢酶对四种黄素的中性（质子化）形式有剧烈偏好，扰动可电离取代基的pK大于或等于4个pH单位。这些结果暗示，在脱氢酶的黄素结合位点中存在强负电荷，而在氧化酶中则缺失。