通过DNA识别位点亲和色谱法纯化核因子I。

核因子I（NF-I）是一种细胞蛋白，可以增强腺病毒DNA复制的起始过程。起始增强与NF-I结合特定核苷酸序列的能力相关。我们开发了一种基于该蛋白与其识别位点之间高亲和力相互作用的NF-I纯化方法。该方法可能普遍适用于其他位点特异性DNA结合蛋白的纯化。该方法的关键特征是一个两步柱色谱程序，首先在由非特异性（大肠杆菌）DNA组成的亲和基质上对蛋白质进行分级，然后在高度富集于NF-I识别的特定DNA序列的基质上进行分级。在第一步中，NF-I与具有相似的一般亲和性结合DNA的蛋白质共同洗脱。在第二步中，NF-I在远高于污染的非特异性DNA结合蛋白的离子强度下洗脱。在第二步中使用的DNA识别位点亲和基质是从一种含有88个NF-I结合位点的质粒（pKB67-88）制备的。这个质粒是通过一种新颖的克隆策略构建的，该策略生成的NF-I结合位点是直接首尾相接配置排列的。使用该纯化方案，我们从粗的HeLa核提取物中获得了2400倍的NF-I纯化，特定DNA结合活性的回收率为57%。在整个纯化过程中，NF-I保持了增强腺病毒DNA复制起始效率的能力。对纯化分级在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上的电泳显示出一群相关多肽，表观分子量范围从66,000到52,000。通过凝胶过滤和甘油沉降研究推断出的NF-I的原生分子量为55,000，摩擦比为1.3。这些结果表明，NF-I在溶液中以球状单体形式存在。