ExoCET：体外外切酶组装结合RecET重组以实现从复杂基因组中高效直接DNA克隆

不断增加的DNA序列数据量突显了探索新信息所需的新DNA克隆方法。在这里，我们描述了“ExoCET”（外切酶结合RecET重组），可以直接从细菌和哺乳动物基因组中以核苷酸精度克隆任何选择的区域到操作质粒中。ExoCET结合体外外切酶和退火与全长RecET同源重组（HR）的显著能力，以从基因组DNA制备中检索指定区域。以T4聚合酶（T4pol）作为ExoCET的体外外切酶，我们直接从细菌和哺乳动物基因组中克隆大区域（>50 kb），包括从血液中分离的DNA。通过在体外采用RecET HR或Cas9切割，可以以核苷酸精度选择直接克隆的区域，例如，将基因定位到表达载体中，而无需进一步的亚克隆。除了在细菌基因组中的生物发现的实用性外，ExoCET为各种应用提供了对哺乳动物基因组的直接访问，例如保留单倍型相位的区域特异性DNA测序、快速构建最佳的单倍型同源靶向构建体，或提供一种新的基因分型方法，相比南方杂交或聚合酶链反应具有优势。ExoCET的直接克隆能力为重组DNA技术带来了新的自由度。