霍乱弧菌 ToxR 调控子的特征分析：鉴定参与肠道定植的新基因

通过使用广宿主范围载体递送转座子 TnphoA，构建了霍乱弧菌古典株（Vibrio cholerae classical strain）O395 的基因融合文库。在含有 0.2% 葡萄糖的 LB 琼脂上于 30 ℃ 下筛选该插入文库中表达碱性磷酸酶阳性（PhoA+）融合蛋白的菌落。分离出 600 多个 PhoA+ 菌株，随后在允许霍乱毒素高表达或低表达的肉汤培养基中测试其基因融合的调控情况。该策略导致分离出 60 个与编码分泌蛋白基因的 TnphoA (Tn5 IS50L::phoA) 融合株，这些基因显然与霍乱毒素协同调控。在其中 10 个融合菌株中引入 toxR 无效突变，证实这些 TnphoA 基因融合直接或间接受到 toxR 编码的霍乱毒素转录激活因子的调控。结合 Southern 印迹和免疫印迹分析，在 V. cholerae O395 中鉴定出 17 个受 ToxR 调控的不同基因。其中许多插入位于 O395 株两个霍乱毒素操纵子拷贝之一中，以及参与毒素共调控菌毛定植因子生物发生的大基因簇中。此外，还在对霍乱毒素或毒素共调控菌毛表达均无影响的基因中鉴定出了插入位点。其中几个插入定位于一个包含四个基因的基因簇中，TnphoA 对其中任何一个基因的破坏都会降低 O395 株在乳鼠肠道内定植的能力。该第二基因簇编码的产物被命名为辅助定植因子，以描述其在霍乱发病机制中的潜在作用。这些研究进一步证实了受 ToxR 调控的基因对 V. cholerae 毒力特性的贡献。本报告还展示了一种基于表征受控制已知毒力因子表达的相同环境信号调控的基因来鉴定细菌毒力因子的新方法。