Insulin und plättchenabgeleiteter Wachstumsfaktor stimulieren die Phosphorylierung des c-raf-Produkts an Serin- und Threonin-Resten in intakten Zellen.

Wir haben die Phosphorylierung der Serin-Threonin-Kinase, des Produkts des c-raf-Protogenes, als Reaktion auf Insulin oder plättchenabgeleiteten Wachstumsfaktor in intakten Zellen untersucht. Sowohl Insulin als auch plättchenabgeleiteter Wachstumsfaktor stimulierten die Phosphorylierung des c-raf-Proteins um etwa das 2- bis 3-Fache. Die Phosphorylierung trat ausschließlich an Serin- und Threonin-Resten auf; Phosphotyrosin wurde nicht nachgewiesen. In immunen Komplex-Kinase-Assays erhöhte die Behandlung mit Insulin und plättchenabgeleitetem Wachstumsfaktor die Autophosphorylierung der c-raf-Kinase, was auf eine Aktivierung ihrer Kinase-Aktivität hindeutet. Um zu untersuchen, ob die Phosphorylierung des c-raf-Proteins in intakten Zellen aus einem Autophosphorylierungsevent oder von der Phosphorylierung durch andere zelluläre Kinasen resultiert, ersetzten wir Lysin 375 im mutmaßlichen ATP-bindenden Bereich des c-raf-Proteins durch Alanin unter Verwendung von oligonukleotidgerichteter Mutagenese und exprimierten das mutierte Protein in NIH3T3-Zellen. Der Austausch führte zur Inaktivierung der spezifischen Autophosphorylierung der Serin/Threonin-Kinase in immunen Komplex-Kinase-Assays. In intakten Zellen trat jedoch die Phosphorylierung des mutierten Proteins als Reaktion auf Insulin und plättchenabgeleiteten Wachstumsfaktor in geringerem Maße auf als die des Wildtyp-Proteins, aber die Phosphopeptid-Karten waren nicht unterscheidbar. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Serin-Threonin-Phosphorylierung für die Aktivierung der c-raf-Kinase bei der Behandlung von Zellen mit Insulin und plättchenabgeleitetem Wachstumsfaktor verantwortlich sein könnte, und der größte Teil des mit dem c-raf-Protein assoziierten Phosphats stammt von seiner Phosphorylierung durch bisher nicht charakterisierte zelluläre Serin/Threonin-Kinasen.