Fluoreszenzbasierte Erkennung von KRAS-Mutationen in genomischer DNA unter Verwendung eines magnetisch gekoppelten LDR-Assays

Wir haben zuvor einen mit Perlen gekoppelten Ligase-Erkennungsreaktions (LDR) Assay entwickelt, der eine einfache und schnelle Erkennung von Einzel-Nukleotid-Variationen (SNVs) mithilfe synthetischer Oligonukleotidvorlagen ermöglicht. In der vorliegenden Studie wurde dieser Ansatz auf genomische DNA erweitert, die aus Kolorektalkrebs-Zelllinien extrahiert wurde, um seine Anwendbarkeit auf klinisch relevante Proben zu bewerten. Zielgerichtet auf Codon 12 des KRAS-Gens dienten PCR-amplifizierte Produkte als Vorlagen für den mit Perlen gekoppelten LDR, und die Analyse der Fluoreszenzanregungs-Emissionsmatrix (EEM) wurde für die Signalauswertung verwendet. Die vier in dem Assay verwendeten Fluorophore wiesen unterschiedliche spektrale Eigenschaften auf, was es ermöglichte, ihre Signale innerhalb der EEM-Profile eindeutig zu unterscheiden. Diese Abbildung lieferte charakteristische Fluoreszenz-Signaturen, die die zugrunde liegenden Genotypen enthüllten, und ermöglichten nicht nur die Unterscheidung zwischen homozygoten und heterozygoten Zuständen, sondern auch die präzise Identifizierung von Allelzusammensetzungen, wie sie durch G/A, T/T, G/G und G/C in Kolorektalkrebs-Zelllinien exemplifiziert wurden. Der Ein-Tube-Workflow, der die Erfassung mit magnetischen Perlen und die fluoreszenzbasierte Erkennung integriert, erwies sich im Vergleich zu herkömmlichen Mutationsnachweismethoden als robust, schnell und kosteneffektiv. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die LDR–EEM-Plattform erfolgreich auf die Analyse genomischer DNA angewendet werden kann, und unterstreichen ihr Potenzial als zugängliches und zuverlässiges Werkzeug für die SNV-Erkennung sowohl in der Forschung als auch im diagnostischen Kontext.