EasyClone‐MarkerFree: Ein Vektortoolkit für die markerlose Integration von Genen in Saccharomyces cerevisiae über CRISPR‐Cas9

Saccharomyces cerevisiae ist ein etablierter industrieller Wirt für die Produktion rekombinanter Proteine, Kraftstoffe und Chemikalien. Um die stabile Integration mehrerer markerfreier Überexpression-Cassetten im Genom von S. cerevisiae zu ermöglichen, haben wir ein Vektortoolkit EasyClone-MarkerFree entwickelt. Die Integration linearisierter Expressions-Cassetten in definierte genomische Loci wird durch CRISPR/Cas9 erleichtert. Cas9 wird durch spezifische Leit-RNAs (gRNAs), die von einer Reihe von gRNA-Helfervektoren exprimiert werden, an den chromosomalen Standort rekrutiert. Mit unserem Genome-Engineering-Vektor-Toolkit werden Einzel- und Dreifach-Integration mit 90-100 % bzw. 60-70 % Zielgenauigkeit erzielt. Wir demonstrieren die Anwendung des Vektortoolkits, indem wir einen haploiden Laborstamm (CEN.PK113-7D) und einen diploiden Industrie-Stamm (Ethanol Red) zur Produktion von 3-Hydroxypropionsäure konstruieren, wobei wir drei verschiedene Acetyl-CoA-Versorgungsstrategien getestet haben, die jeweils eine Überexpression von drei bis sechs Genen erforderten. Unter den getesteten Strategien befand sich ein bakterieller cytosolischer Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, der in einer einzigen Transformation in das Genom integriert wurde. Das öffentlich verfügbare EasyClone-MarkerFree-Vektorsuite ermöglicht eine einfache und hochgradig standardisierte Genom-Engineering und sollte für Forscher, die an Hefechassis mit begrenzten verfügbaren Markern arbeiten, von besonderem Interesse sein.