Mesure des niveaux de métabolites sous-cellulaires dans les feuilles par fractionnement de matériel arrêté par congélation dans des milieux non aqueux

Cet article décrit une technique pour mesurer les niveaux de métabolites in vivo dans le stroma chloroplastique, le cytosol et la vacuole des feuilles d'épinard (Spinacia oleracea hybride 424 des États-Unis). Les feuilles d'épinard ont été arrêtées par congélation, le tissu congelé a été broyé et lyophilisé. Le matériau sec a été homogénéisé par sonication dans un mélange de tétrachlorure de carbone et d'hexane, et fractionné par centrifugation en gradient de densité. Les mesures de l'activité des enzymes marqueurs dans divers compartiments sous-cellulaires montrent que le matériel chloroplastique apparaît principalement dans les fractions les plus légères et que le matériel cytosolique se trouve au milieu du gradient, tandis que la plupart du matériel vacuolaire se trouve dans la fraction la plus lourde. En utilisant les distributions mesurées des métabolites et des enzymes marqueurs dans chaque fraction du gradient, la distribution sous-cellulaire du métabolite peut être calculée. Comme première application, la nouvelle technique de fractionnement a été utilisée pour étudier les contenus sous-cellulaires de malate et de saccharose dans les feuilles d'épinard. Les résultats montrent d'importants changements diurnes de saccharose et de malate, les deux substances étant principalement localisées dans le compartiment vacuolaire. Environ trois fois plus de malate est présent à la fin de la journée qu'à la fin de la nuit. Le contenu en saccharose dans la vacuole chute d'un maximum de 45 millimolaires à la fin de la journée à une valeur presque indétectable d'environ 1 millimolaire à la fin de la nuit.