Warum weniger mehr ist bei der Generierung von tryptischen Peptiden in der Bottom-up-Proteomik

Die proteolytische Verdauung ist ein zeitaufwändiger und kritischer Schritt in der Bottom-up-Proteomanalyse. Das am häufigsten verwendete Protease, Trypsin, hat eine hohe Spezifität und erzeugt Peptide, die als ideal für die Bottom-up-LC-MS-Technologie angesehen werden. Durch die Ausnutzung wichtiger Faktoren, die die enzymatische Aktivität beeinflussen, haben wir ein einfaches, unkompliziertes und schnelles In-Lösung-Verdauungsprotokoll entwickelt, das im Vergleich zur konventionellen Übernachtverdauungsmethode in Bezug auf die Aminosäurendeckung von Proteinen, die Anzahl der erzeugten Peptide und die Peptidionenabundanzen besser abschnitt. Eine verlängerte Verdauungszeit, wie beispielsweise eine Übernachtverdauung, führt zu einem Rückgang der Aminosäurendeckung von Proteinen und zum Verlust von tryptischen Peptiden. Dies wurde durch eine vollständige Verdauung durch Trypsin verursacht, die zu einer erhöhten Anzahl kleiner Peptide führt, die nicht mit LC-MS nachweisbar sind. Eine langsame, nicht-tryptische Verdauung von Peptiden ist ein beitragender Faktor für den Verlust der Peptidionenintensitäten während einer verlängerten Verdauungszeit. Unsere Arbeit zeigt, dass es sowohl für qualitative als auch quantitative Bottom-up-Proteomstudien vorteilhaft ist, zu verhindern, dass die Trypsinverdauung vollständig abgeschlossen wird, indem die Behandlungszeit von den traditionellen mehreren Stunden auf einige Minuten verkürzt wird.