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Die Sequenzierung einzelner Moleküle erfordert optimierte Protokolle zur Proben- und Bibliotheksvorbereitung, um lange Leseverläufe und hohe Sequenzierausbeuten zu erzielen. Es gibt zahlreiche Protokolle zur Extraktion von DNA aus Pflanzenarten, aber die genomische DNA aus diesen Extraktionen hat entweder zu niedrige Ausbeuten, ist nicht rein genug für empfindliche Sequenzierplattformen wie die Nanopore-Sequenzierung, ist zu fragmentiert, um lange Reads zu erreichen, oder ist anderweitig aus wiederspenstigem Erwachsenen-Gewebe nicht zu gewinnen. Dies macht viele Pflanzen-Sequenzierungsprojekte kostspielig oder methodologisch unlösbar. Bestehende Protokolle sind auch arbeitsintensiv und benötigen Tage zur Durchführung. Unser hier beschriebenes Protokoll liefert Mikrogramm hochmolekularer gDNA aus einem einzigen Gramm erwachsenen oder keimenden Blättergewebe in nur wenigen Stunden und produziert hochwertige Sequenzierbibliotheken für das Oxford Nanopore-System, mit typischen Ausbeuten von 3-10 Gb pro R9.4.1-Flusszelle und erzeugt Reads mit einer durchschnittlichen Länge von 5-8 kb, wobei die Lese-Länge N50 von 6-30 kb reicht, je nach Art der Bibliotheksvorbereitung (Details im Abschnitt Sequenzierungsergebnisse), und maximale Längen bis zu 200 kb+ erreichen. Herausgebernotiz, 18. Juni 2018: Schritt 12 des Verfahrens wurde aktualisiert. Die Originalversion des Protokolls finden Sie "hier":http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/6879/original/HighMolecularWeightDNAExtractionfromRecalcitrantPlantSpeciesforThirdGenerationSequencing-Version1-ProtocolExchange.pdf?1529318652.
Workman et al. (Freitag) untersuchten diese Frage.