Genauigkeit, Präzision und Nachweisgrenzen von quantitativer PCR für luftgetragene Bakterien und Pilze

Die Echtzeit-quantitative PCR (qPCR) zur schnellen und spezifischen Zählung mikrobieller Agenzien findet zunehmend Verwendung in der Aerosolforschung. Ziel dieser Studie war es, die Genauigkeit, Präzision und Nachweisgrenzen (MDLs) von qPCR im Kontext von Innen- und Außenluft-Aerosolproben zu bestimmen. Es wurden Escherichia coli und Bacillus atrophaeus vegetative Bakterienzellen sowie Aspergillus fumigatus Pilzsporen, die auf Aerosolfilter geladen waren, betrachtet. Die Effizienzen im Zusammenhang mit der Rückgewinnung von DNA aus Aerosolfiltern waren gering, und das Ausschließen dieser Effizienzen in der quantitativen Analyse führte zu einer Unterschätzung der tatsächlichen Aerosolkonzentration um das 10- bis 24-Fache. Die Präzision nahe den Nachweisgrenzen variierte zwischen einem Variationskoeffizienten (COV) von 28 % bis 79 % für die drei Testorganismen, und der Großteil dieser Variation war auf die Wiederholbarkeit des Instruments zurückzuführen. Abhängig vom Organismus und dem Material des Probenfiltrats deuten die Präzisionsergebnisse darauf hin, dass qPCR nur dann nützlich ist, um die Unterschiedlichkeit zwischen zwei Proben zu bestimmen, wenn die tatsächlichen Unterschiede größer sind als 1,3 bis 3,2-mal (95 % Konfidenzniveau bei n = 7 Wiederholungen). Für die MDLs war qPCR in der Lage, mit 99 %iger Sicherheit eine positive Antwort aus der DNA von fünf B. atrophaeus-Zellen und weniger als einer A. fumigatus-Spore zu liefern. Die Gesamte MDL-Werte, die die Effizienzen der Probenverarbeitung einbezogen, lagen zwischen 2.000 und 3.000 B. atrophaeus-Zellen pro Filter und 10 bis 25 A. fumigatus-Sporen pro Filter. Die Anwendung der Konzepte Genauigkeit, Präzision und MDL auf qPCR-Aerosolmessungen zeigt, dass die Effizienzen der Probenverarbeitung berücksichtigt werden müssen, um die Bioaerosol-Exposition genau zu schätzen, bietet Leitlinien zur notwendigen statistischen Strenge, um signifikante Unterschiede zwischen separaten Aerosolproben zu verstehen, und verhindert unentdeckte (d.h. nicht quantifizierbare) Werte für tatsächliche Aerosolkonzentrationen, die signifikant sein könnten.