mTOR·RICTOR ist die Ser473 Kinase für Akt/Protein Kinase B in 3T3-L1 Adipozyten

Der Insulin-Signalweg, der zur Aktivierung von Akt/Protein Kinase B führt, wurde gut charakterisiert, mit Ausnahme eines einzelnen Schrittes, der Phosphorylierung von Akt an Ser-473. Der DNA-abhängige Protein-Kinase (DNA-PK), das Genprodukt von Ataxia telangiectasia mutated (ATM), die integrin-verknüpfte Kinase (ILK), die Protein-Kinase Calpha (PKCalpha) und der mamalian Ziel von Rapamycin (mTOR), wenn komplexiert mit dem rapamycin-unempfindlichen Begleiter von mTOR (RICTOR), wurden alle als entscheidend für die Phosphorylierung von Akt Ser-473 identifiziert. Die anscheinend unterschiedlichen Ergebnisse in diesen Studien sind jedoch schwer auszuwerten, da unterschiedliche Stimuli und Zelltypen untersucht wurden und keine der Kandidaten-Proteine jemals systematisch in einem einzigen System untersucht wurde. Darüber hinaus wurden keine dieser Studien an einem klassischen insulinempfindlichen Zelltyp oder Gewebe wie Muskel oder Fett durchgeführt. Daher haben wir jeden dieser Kandidaten in 3T3-L1 Adipozyten untersucht. In vitro Kinase-Assays unter Verwendung verschiedener subzellulärer Fraktionen von 3T3-L1 Adipozyten zeigten, dass die durch Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphat stimulierte Ser-473-Phosphorylierung gut mit der Menge an DNA-PK, mTOR und RICTOR korrelierte, jedoch nicht mit den Konzentrationen von ATM, ILK und PKCalpha. PKCalpha war vollständig abwesend aus Kompartimenten mit Ser-473-Phosphorylierungsaktivität. Obwohl gereinigtes DNA-PK ein Peptid aus Akt, das die Aminosäure Ser-473 enthält, phosphorylieren konnte, konnte es nicht das vollständige Akt2 phosphorylieren. Von niedrigen Dichte-Mikrosomen immunpräzipitierte Vesikel, die mit Antikörpern gegen mTOR oder RICTOR behandelt wurden, wiesen eine durch Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphat stimulierte Ser-473-Aktivität auf, die empfindlich auf Wortmannin, jedoch nicht auf Staurosporin war. Im Gegensatz dazu konnten immunrein gereinigte niedrigdichte Mikrosomenvesikel, die ILK enthielten, Akt in vitro nicht an Ser-473 phosphorylieren. Kleininterferenz-RNA-Knockdown von RICTOR, jedoch nicht von DNA-PK, ATM oder ILK, unterdrückte die insulin-aktivierte Ser-473-Phosphorylierung und, in geringerem Maße, Thr-308-Phosphorylierung in 3T3-L1 Adipozyten. Basierend auf unseren zellfreien Kinase- und kleininterferenz-RNA-Ergebnissen ziehen wir den Schluss, dass mTOR in Komplex mit RICTOR die Ser-473-Kinase in 3T3-L1 Adipozyten ist.