Caractérisation approfondie du protéome proximal du promoteur du locus FOXP2 à copie unique

Identifier les protéines qui interagissent avec des segments de chromatine définis par leur séquence est une étape critique pour comprendre l'expression génique. La plupart des procédures effectuent une analyse en vrac des échantillons pour identifier les interactions générales qui se produisent dans une population cellulaire et ne détectent donc pas les protéines qui fonctionnent à un locus unique. Pour contourner cette limitation, nous avons développé une méthode modifiée utilisant le marquage de proximité ciblé génétiquement avec dCas9-APEX2 pour biotinylater spécifiquement le protéome proximal du promoteur du locus FOXP2 à copie unique dans des cellules HEK293 vivantes. Après capture des protéines marquées avec de la streptavidine et marquage isobarique des peptides produits par digestion sur perles avec des étiquettes de masse en tandem, nous avons utilisé une LC-MS3 quantitative 2D sur un spectromètre de masse tribride pour identifier 373 protéines significativement enrichies au promoteur actif par rapport aux échantillons témoins (Storey-q1.2). Ces protéines étaient enrichies en facteurs de transcription et en composants du spliceosome. Pour valider nos régulateurs transcriptionnels candidats, nous avons utilisé le prédictif computationnel du couplage des facteurs de transcription et les >200 expériences ChIP-Seq réalisées dans des cellules HEK293 par ENCODE. En plus de valider des dizaines de facteurs de transcription candidats comme étant des ligands du locus génomique ciblé, nous identifions nouvellement IRF2BP2 et le signalement des glucocorticoïdes comme régulateurs négatifs de la transcription de FOXP2, suggérant qu'ils jouent chacun un rôle clé dans l'expression génique de FOXP2. Nous démontrons en outre que la MS détecte environ un tiers des ligands et des non-ligands, les gènes plus fortement exprimés ayant une probabilité significativement plus élevée d'être détectés, indépendamment du statut de liaison ou de la spécificité du locus. Les ligands ChIP-Seq d'ENCODE non détectés par la MS montrent une expression significativement plus faible par rapport aux non-ligands uniquement au promoteur ciblé de FOXP2 et non aux loci hors cible.