Regionalisierte GC-Inhalt der Template-DNA als Prädiktor für PCR-Erfolg

Ein Satz von 1438 menschlichen Exonen wurde einer nested PCR unterzogen. Die anfängliche Erfolgsquote unter Verwendung eines Standard-PCR-Protokolls, das für die ligation-unabhängige Klonierung erforderlich ist, betrug 83,4 %. Eine logistische Regressionsanalyse wurde auf 27 primer- und templatebezogene Merkmale durchgeführt, von denen die meisten ignoriert werden konnten, abgesehen von denen, die mit dem GC-Inhalt des Templates zusammenhingen. Der gesamte GC-Inhalt des Templates war ein guter Prädiktor für den PCR-Erfolg; jedoch wurden die Spezifitäts- und Sensitivitätswerte für das vorhergesagte Ergebnis auf 84,3 bzw. 94,8 % verbessert, wenn regionalisierter GC-Inhalt verwendet wurde. Dies stellte eine signifikante Verbesserung der Vorhersagbarkeit im Hinblick auf den GC-Inhalt allein dar (P < 0,001; chi(2)) und wird voraussichtlich mit zunehmender Template-Größe in der relativen Sensitivität zunehmen. Der regionalisierte GC wurde in Bezug auf einen Schwellenwert von 61 % GC-Inhalt und ein gleitendes Fenster von 21 bp über die Zielsequenz berechnet. Eine Feinabstimmung der PCR-Bedingungen ist nicht praktikabel für alle Zielsequenzen, wenn eine große Anzahl von Genen unterschiedlicher Längen und GC-Gehalte parallel amplifiziert werden soll, insbesondere wenn die totale offenen Leserahmen- oder Domänenabdeckung für die Synthese rekombinanter Proteine von wesentlicher Bedeutung ist. Daher wird die vorliegende Methode als Mittel vorgeschlagen, um Teilmengen von Genen zu gruppieren, die potenziell schwierige Zielsequenzen aufweisen, damit die PCR-Bedingungen separat optimiert werden können, um verbesserte Ergebnisse zu erzielen.