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Das CRISPR-Cas9-System wird häufig für zielgerichtete Genom-Engineering verwendet. CRISPR-Cas12a (Cpf1) ist einer der CRISPR-Effektorproteine, die Zielgene durch Erkennung von thymidinreichen protospacernachbarmotiven (PAM) steuern. Cas12a hat eine höhere Empfindlichkeit gegenüber Fehlanpassungen in der Leit-RNA als Cas9; daher sind die Erkennung und Spaltung von Off-Target-Sequenzen geringer. Es toleriert jedoch Fehlanpassungen in Regionen, die von der PAM-Sequenz (TTTN oder TTN) im Protospacer entfernt sind, und Off-Target-Spaltungsprobleme können problematischer werden, wenn die Cas12a-Aktivität für therapeutische Zwecke verbessert wird. Daher untersuchten wir die Off-Target-Spaltung durch Cas12a und modifizierten die Cas12a (cr)RNA, um das Off-Target-Spaltungsproblem anzugehen. Wir entwickelten ein CRISPR-Cas12a, das Mutationen in Ziel-DNA-Sequenzen auf hoch spezifische und effektive Weise induzieren kann, indem wir die (cr)RNA teilweise durch DNA ersetzen, um das energetische Potenzial der Basenpaarung zur Ziel-DNA zu ändern. Ein Modell wird vorgeschlagen, um zu erklären, wie chimäre (cr)RNA-gesteuerte CRISPR-Cas12a und SpCas9 Nickase effektiv im intrazellulären Genom arbeiten. Die chimären Leitfaden-basierten CRISPR-Cas12a-Genomeditoring mit reduzierter Off-Target-Spaltung und die daraus resultierende erhöhte Sicherheit haben Potenzial für therapeutische Anwendungen bei unheilbaren Erkrankungen, die durch genetische Mutationen verursacht werden.
Kim et al. (Di,) untersuchten diese Frage.