Reverse-Genetik mit einem voll-längigen infektiösen cDNA des Coronavirus des Middle East Respiratory Syndrome

Das schwere akute Atemwegssyndrom mit hohen Sterblichkeitsraten (~50%) ist mit einer neuen Gruppe von 2c Betacoronaviren verbunden, die als Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) bezeichnet wird. Wir synthetisierten ein Panel von zusammenhängenden cDNAs, die das gesamte Genom umspannten. Nach der Zusammenstellung der Contigs zu einer Genom-langen cDNA erbrachten transmanipulierte voll-längige Transkripte mehrere rekombinante Viren (rMERS-CoV), die die erwarteten Markermutationen enthielten, die in die Komponentenklone eingefügt waren. Da das Wildtyp-MERS-CoV eine für die Zellkultur angepasste T1015N-Mutation im S-Glykoprotein enthält, replizierte rMERS-CoV ~0,5 Log weniger effizient als das Wildtyp-Virus. Darüber hinaus haben wir die Expression des Zubehörproteins ORF5 (rMERS•ORF5) deaktiviert und es durch ein tomatenrotes fluoreszierendes Protein (rMERS-RFP) ersetzt oder den gesamten ORF3, 4 und 5 Zubehörcluster gelöscht (rMERS-ΔORF3-5). Rekombinante rMERS-CoV, rMERS-CoV•ORF5 und MERS-CoV-RFP replizierten zu hohen Titer, während MERS-ΔORF3-5 einen um 1-1,5 Logs reduzierten Titer im Vergleich zu rMERS-CoV zeigte. Northern-Blot-Analysen bestätigten die damit verbundenen molekularen Veränderungen in den rekombinanten Viren, und die Sequenzanalyse zeigte, dass RFP aus der entsprechenden Konsensussequenz AACGAA exprimiert wurde. Wir zeigen ferner die Expression der Dipeptidylpeptidase 4, die MERS-CoV-Replikation sowie RNA- und Proteinsynthese in menschlichen Atemwegsepithelzellen, primären Lungenfibroblasten, primären mikrovaskulären Endothelzellen der Lunge und primären alveolären Typ-II-Pneumozyten, was ein viel breiteres Gewebe-Tropismus als beim schweren akuten Atemwegssyndrom-Coronavirus demonstriert. Die Verfügbarkeit eines MERS-CoV-Molekularklons sowie rekombinanter Viren, die Indikatorproteine exprimieren, wird Hochdurchsatz-Tests von therapeutischen Verbindungen ermöglichen und eine genetische Plattform für das Studium der Genfunktion und das rationale Design von lebenden Virusimpfstoffen bereitstellen.