ACAT1和ACAT2膜拓扑将对活性至关重要的丝氨酸残基分隔到内质网膜的相对两侧

已鉴定出酶脂酰辅酶A：胆固醇酰基转移酶的第二种形式ACAT2。为了探讨两个ACAT酶有分开功能的假说，检查了ACAT1和ACAT2的膜拓扑结构。一个糖基化报告者和FLAG表位标签序列被附加到一系列在每个预测的跨膜结构域后被截断的ACAT cDNA上。融合构建在体外组装到微粒膜中，并根据糖基化位点的使用和对外源性蛋白酶的可及性确定了拓扑结构。通过免疫荧光显微镜在透膜转染细胞中确定构建中C末端FLAG表位的可及性。ACAT1和ACAT2都穿越膜五次，其N末端位于细胞质中，C末端位于内质网腔中。第四个跨膜结构域在每种蛋白质中的位置不同，将假定的活性位点ACAT1丝氨酸（Ser(269)）置于细胞质中，而ACAT2中对应的残基（Ser(249)）则位于内质网腔中。这些丝氨酸的突变使ACAT酶失活。结果与假说一致，即ACAT2的胆固醇酯形成可能与脂蛋白颗粒的组装和分泌相关，而ACAT1主要功能是维持细胞内游离胆固醇和酯化胆固醇的平衡。