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Die RNA-Sequenzierung bietet Vorteile gegenüber anderen Quantifizierungsmethoden für MikroRNA (miRNA), dennoch machen zahlreiche Verzerrungen eine zuverlässige Quantifizierung herausfordernd. Frühere Bewertungen dieser Verzerrungen konzentrierten sich auf die Verzerrung durch Adapterligierung mit begrenzter Bewertung der Verzerrung bei der reversen Transkription oder der Amplifikationsverzerrung. Darüber hinaus waren die Bewertungen der Quantifizierung von IsomiRs (miRNA-Isoformen) oder der Einfluss des Ausgangsvolumens auf die Leistung sehr begrenzt. Bislang hatte keine Studie die Quantifizierung von IsomiRs mit veränderter Länge bewertet oder die Konsistenz der Ergebnisse aus mehreren moderaten Ausgangsmengen verglichen. Wir haben daher die Quantifizierungen von miRNA und IsomiRs unter Verwendung von vier Bibliotheksvorbereitungskits mit verschiedenen Ausgangsmengen sowie die Quantifizierungen nach der Entfernung von Duplikatlesungen mit einzigartigen molekularen Identifikatoren (UMIs) zur Minderung von Verzerrungen bei der reversen Transkription und Amplifikation bewertet. Alle Methoden führten zu falschen IsomiR-Nachweisen; die getestete adapterfreie Methode war jedoch besonders anfällig für falsche IsomiR-Nachweise. Wir zeigen, dass die Verwendung von UMIs die Genauigkeit verbessert, und bieten einen Leitfaden für Eingangsgrößen zur Verbesserung der Konsistenz. Unsere Daten zeigen Unterschiede und Einschränkungen der aktuellen Methoden und werfen somit Bedenken hinsichtlich der Validität der Quantifizierung von miRNA und IsomiRs über Studien hinweg auf. Wir plädieren für die Verwendung von UMIs zur Verbesserung der Genauigkeit und Zuverlässigkeit von miRNA-Quantifizierungen.
Wright et al. (Fri,) haben diese Frage untersucht.