通过阴离子交换色谱纯化荧光团标记蛋白质的系统性方法

Förster共振能量转移（FRET）作为一种光学距离标尺，具有监测单个生物大分子和多亚基复合物中分子相互作用及构象变化的独特能力。事实证明，它已成为研究酶促反应、跨膜转运、蛋白质折叠，以及核酸、蛋白质、分子马达和许多其他生物系统与过程特性的有力工具。进行FRET的先决条件是用两种不同的荧光团对大分子进行靶向（共价）标记。在此，我们提出了一种通过阴离子交换色谱对蛋白质残基进行所需供体和受体染料随机标记的策略。虽然该技术此前曾用于此目的，但我们提供了一个概念基础，可针对荧光团的任意选择系统地设计纯化方案。通过表征水解荧光团-马来酰亚胺与色谱柱材料的相互作用，我们能够选择（并预测）哪些荧光团对可以成功纯化供体-受体标记的蛋白质，产率高达98%。我们展示了该方法在多种细菌底物结合蛋白的群体和单分子FRET测定中的应用能力，这些蛋白质是可溶性、已折叠且经充分表征的蛋白质系统范例。