Laser-based mid-infrared spectroscopy of aqueous protein solutions: From spectra to information through chemometrics

Die Fourier-Transformations-Infrarot (FTIR)-Spektroskopie im mittleren Infrarotbereich ist eine etablierte Analysentechnik für markierungsfreie Technik für Struktur-Funktions-Studien von Proteinen. In diesem spektralen Bereich liefert vor allem die Amid-I-Bande eine Fülle von Informationen über die Sekundärstruktur von Proteinen, welche für die normale Aktivität und Funktion von Proteinen unerlässlich ist. Die Verwendung thermischer Lichtquellen in der FTIR-Spektroskopie schränkt jedoch die mit Messungen in Wasser kompatible Weglänge ein, da das Licht durch die Biegeschwingung des Wassers von 1640 cm−1 bis 1655 cm−1 fast vollständig absorbiert wird, was die Analyse der Amid-I-Bande erschwert. Folglich ist der Konzentrationsbereich, der untersucht werden kann, begrenzt. Die geringe Weglänge in der FTIR-Spektroskopie schränkt auch Durchflussmessungen und Denaturierungsstudien ein, da das Risiko einer Verstopfung der Messzellen erhöht ist. Als Lösung für das Problem der starken Wasserabsorption werden in dieser Arbeit Laser eingesetzt, um die Nachteile der FTIR-Spektroskopie zu überwinden, da sie eine fast 104 mal höhere Leistungsdichte als die traditionell verwendeten Lichtquellen bieten.Die hohe spektrale Leistungsdichte von Laserlichtquellen in der Infrarotspektroskopie verhindert die Abschwächung des Lichts unterhalb der Empfindlichkeitsschwelle des Detektors und ermöglicht so die Untersuchung von Proteinen in einer wässrigen Umgebung. Ein weiterer großer Vorteil dieser erhöhten spektralen Leistungsdichte ist die Möglichkeit, längere Weglängen zu verwenden, was eine effektivere Überwachung der Proteindenaturierung ermöglicht und kontinuierliche Durchflussmessungen unterstützt. Eine große Herausforderung bleibt jedoch bestehen: die intrinsische Komplexität der Amid-I-Bande, die die Interpretation der Messdaten erschwert.In dieser Arbeit wird anhand von drei verschiedenen Veröffentlichungen die Verwendung der Kombination aus laserbasierter Mid-IR-Spektroskopie und multivariater Kurvenauflösung – alternierende kleinste Quadrate (MCR-ALS) als Werkzeug zur Dekonvolution der komplexen Amid-I-Bande demonstriert. Die erste Veröffentlichung in dieser Arbeit veranschaulicht die Nützlichkeit von MCR-ALS bei der Suche nach Zwischenprodukten während der Proteindenaturierung durch seine Anwendung auf die thermische Denaturierung von Rinderserumalbumin (BSA). Diese Arbeit betont auch die Bedeutung der Wahl der Anzahl der Komponenten, die zur Erstellung von Modellen verwendet werden, und nutzt die aus MCR-ALS gewonnenen Fehlermatrizen, um das Ausmaß und die Konzentration der Informationen aufzuzeigen, die vom Modell nicht erklärt werden können, wenn eine geringere Anzahl von Komponenten als erforderlich gewählt wird. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit ein praktischer Aspekt für Proteine berücksichtigt: ihre Lagerung und die Auswirkungen der Lagerung auf ihre Sekundärstruktur. Zu diesem Zweck wird die laserbasierte Mid-IR-Spektroskopie verwendet, um die Auswirkungen von vier Zuckern, Saccharose, Sucralose, Mannose und Trehalose, auf die Denaturierungstemperatur von Proteinen zu untersuchen. Das Ergebnis zeigt die überlegene Leistung von Trehalose in niedrigen Konzentrationen als Stabilisator und die destabilisierende Wirkung von Sucralose auf Proteine.In der zweiten Veröffentlichung, die in dieser Arbeit vorgestellt wird, wird die Rotationsmehrdeutigkeit von MCR-ALS bei der Verwendung als Werkzeug zur Untersuchung der Denaturierung untersucht. Die chemische Denaturierung von β-Lactoglobulin (BLG) durch Natriumdodecylsulfat (SDS) und die anschließende Renaturierung durch Octaethylenglykolmonododecylether (C12E8) wird als Modellsystem verwendet, um zu zeigen, wie komplexe Hintergründe zu mehreren mathematisch möglichen Lösungen in MCR-ALS führen können. Es wird eine Verbesserung in Form eines „verknüpften PLS” vorgestellt, die nicht nur die Komplexität der Hintergrundspektren berücksichtigt, sondern auch die Rotationsmehrdeutigkeit in MCR-ALS reduziert. Das verknüpfte PLS nutzt die gemeinsamen Spektralbereiche des Hintergrunds und der Proteinspektren, um den Hintergrundbeitrag in jedem Proteinspektrum zu schätzen, der anschließend von den Proteinspektren subtrahiert werden kann. Bei Verwendung als Vorverarbeitungsschritt vor MCR-ALS führt das verknüpfte PLS zu einer geringeren Rotationsmehrdeutigkeit bei der Untersuchung der Proteindenaturierung mit MCR-ALS. Schließlich wird eine Datenfusion zwischen den Spektren im mittleren Infrarotbereich und im Zirkulardichroismus (CD) der thermischen Denaturierung von α-Chymotrypsin (ACT) unter Verwendung von MCR-ALS demonstriert. Der Hauptvorteil dieser Art der Datenfusion besteht darin, dass sie die Grenzen der mit beiden Analysetechniken messbaren Konzentrationsbereiche überwindet. Zu diesem Zweck wird eine verbesserte Version von MCR-ALS verwendet, die einen Ein-Faktor-Ansatz zur Behandlung fehlender Daten im fusionierten Datensatz nutzt, wodurch Teile des Spektrums, die aufgrund von Konzentrationseffekten von Sättigung betroffen sind, aus der Analyse herausgenommen werden können. Der Vergleich der Ergebnisse der Datenfusion mit denen der Analyse der einzelnen Techniken hebt nicht nur die unterschiedliche Empfindlichkeit der beiden Techniken gegenüber verschiedenen Sekundärstrukturmotiven des Proteins hervor, sondern führt auch zur Entdeckung eines Zwischenprodukts während der thermischen Denaturierung von ACT.