内皮一氧化氮合酶中的电子转移、氧结合与一氧化氮反馈抑制

我们研究了构成一氧化氮（NO）合成初始和稳态阶段的步骤，以了解牛内皮一氧化氮合酶（eNOS）活性的调节机制。对NADPH依赖的黄素还原的停止流分析显示，随着钙调素结合，反应速率从0.13增加到86 s(-1)，但这在存在阿根廷酸或N(ω)-羟基-L-精氨酸时支持缓慢的血红素还原（在10摄氏度下分别为0.005和0.014 s(-1)）。O(2)结合于亚铁eNOS生成了瞬态的亚铁二氧物种（Soret峰在427 nm），其生成和衰减动力学表明它可以参与NO合成。在厌氧条件下和NO合成初始阶段下，血红素-NO复合物的形成动力学得到了特征化。在催化过程中，血红素-NO复合物的形成需要相对高的溶液NO浓度（>50 nm）的积累，这在N(ω)-羟基-L-精氨酸作为底物时很容易实现，而用阿根廷酸作为底物则达不到。血红素-NO复合物的形成使得eNOS的NADPH氧化和瓜氨酸合成减少了3倍，并且O(2)的表观K(m)增加了6倍。我们的主要结论是：1）eNOS对NO合成的慢稳态速率主要是由于其还原酶域向血红素的电子转移缓慢，而不是血红素-NO复合物的形成或催化的其他方面。2）在从阿根廷酸合成NO的过程中，eNOS形成的血红素-NO复合物相对较少，暗示NO反馈抑制的作用非常有限。这些特性将eNOS与其他NOS亚型区分开来，并为更好地理解其在生理和病理中的作用提供了基础。