Histidin-Scanning-Mutagenese der basischen Reste des S4-Segments des Shaker K+-Kanals

Der Spannungssensor des Shaker-Kaliumkanals besteht hauptsächlich aus positiv geladenen Resten im vermeintlichen vierten Transmembransegment, S4 (Aggarwal, S.K., und R. MacKinnon. 1996. Neuron. 16:1169-1177; Seoh, S.-A., D. Sigg, D.M. Papazian, und F. Bezanilla. 1996. Neuron. 16:1159-1167). Die Bewegung des Spannungssensors als Reaktion auf eine Änderung des Membranpotentials wurde indirekt untersucht, indem gemessen wurde, wie sich die Zugänglichkeit der Reste im und um den Sensor mit der Spannung ändert. Jeder basische Rest im S4-Segment wurde einzeln durch Histidin ersetzt. Wenn der Histidin-Tag Teil des Spannungssensors ist, wird die von dem Spannungssensor verdrängte Ladung das Histidin-Ladung einschließen. Die Zugänglichkeit des Histidins zur Lösung wurde daher als pH-abhängige Änderungen der Gating-Ströme überwacht, die durch Membranpotentialpulse hervorgerufen wurden. Histidin-Scanning-Mutagenese hat mehrere Vorteile gegenüber anderen ähnlichen Techniken. Da die Zugänglichkeit von Histidin durch die Markierung mit Lösungsprotonen erfasst wird, können sehr eingegrenzte lokale Umgebungen aufgelöst werden, und die Markierung führt zu minimalen Störungen der Bewegung des Spannungssensors. Nach dem Histidin-Ersatz entweder des Restes K374 oder R377 gab es keine Titration der Gating-Ströme mit internem oder externem pH, was darauf hindeutet, dass diese Reste sich im transmembranen elektrischen Feld nicht bewegen oder dass sie immer unzugänglich sind. Der Histidin-Ersatz der Reste R365, R368 und R371 zeigte hingegen, dass jeder dieser Reste vollständig von interner Exposition bei hyperpolarisierten Potentialen zu externer Exposition bei depolarisierten Potentialen übergeht. Diese Translokation ermöglicht es, dass Histidin Protonen über die Membran im Vorhandensein eines pH-Gradienten transportiert. Im Fall von 371H treibt die Depolarisation das Histidin in eine Position, die ein Protonenloch bildet. Kinetische Modelle von titrierbaren Spannungssensoren, die den Protonentransport und die Leitfähigkeit berücksichtigen, werden vorgestellt. Schließlich werden die hier präsentierten Ergebnisse in bestehende Informationen integriert, um ein Modell der Bewegung und Struktur des Spannungssensors vorzuschlagen.