A Fluorescence Dequenching-based Liposome Leakage Assay to Measure Membrane Permeabilization by Pore-forming Proteins

Pore-forming toxins (PFTs) have been discovered in a wide range of organisms. Their functions are essential to the survival or virulence of many species. PFTs often interact with lipid membranes. Large unilamellar vesicles (LUV), also known as liposomes, have been commonly used as reliable membrane models for testing PFTs activity. Liposomes have great adaptability in size, lipid composition, and loading cargo. Incorporating the fluorescent dye/quencher pair, 8-Aminonaphthalene-1,3,6-Trisulfonic Acid (ANTS) and p-Xylene-Bis-Pyridinium Bromide (DPX), in liposomes is an effective approach for measuring membrane leakage. When ANTS and DPX are encapsulated in a liposome, the fluorescence of ANTS is quenched by DPX. However, disruption of liposome integrity and subsequent leakage result in measurable fluorescence emitted by ANTS. Here, we report our protocol for optimal liposome preparation for measuring liposome leakage by fluorescence dequenching., [摘要]在多种生物中都发现了成孔毒素（PFT s）。其功能是对基本的生存或致病许多种。PFT经常与脂质膜相互作用。大单层囊泡（LUV），也被称为脂质体，已被广泛用作可靠膜模型小号用于测试的PFT活动。脂质体在大小，脂质组成， 和装载货物。结合了荧光染料/淬灭剂对，8-氨基萘-1,3,6-三磺酸（ANTS）和对二甲苯双-吡啶溴化物（DPX），在脂质体中是一种有效的方法用于测量膜渗漏。当ANTS和DPX封装在脂质体中时，ANTS的荧光会被DPX淬灭。然而，脂质体完整性的破坏和随后的泄漏导致ANTS发出可测量的荧光。在这里，我们报告我们的最佳协议脂质体的测量电准备ING荧光脱猝灭脂质体渗漏。[背景]成孔毒素（的PFT）是由主机入侵微生物病原体的毒力产生因子家族（Alouf等人。，2005）。的PFT的主要作用是形式ING孔上脂膜，造成膜的裂解和/或易位其他效应蛋白进入宿主细胞（Bischofberger等人。，2009）。脂质体小号公顷VE长期用作生物膜模型用于蛋白质-膜相互作用小号由于它们在大小，脂质组成极大的适应性，和装载货物（Chatterjee的和瓦尔，1988）。使用脂质体来测量孔的形成或膜渗漏的一种常见方式是封装离子或fluorescen吨脂质体内染料秒。ü PON的脂质体破裂，所述释放d离子或fluorescen吨染料EMIT可测量信号。我们首先使用一个ķ +释放测定以测量在脂质体膜孔形成小号通过的炭疽毒素（太阳等人，2007。和2008; Sun和科利尔，2010）。以后，荧光染料和淬灭剂对ANTS / DPX Ç一个ught （我们的注意力Nieva等人。，1989; Ruiz-阿圭略等人。，1996）。相比与所述ķ +释放测定，这需要一个庞大的ķ +探针和昂贵探针膜的频繁变化，所述ANTS / DPX去淬灭测定功能更高的灵敏度，更准确和一致的测量小号，和更低的成本。因此，在过去的十几年，我们已经转移到了蚂蚁/ DPX脱猝灭法。与此测定中，我们已经成功地测量到的膜透活性（MPA）的结核分枝杆菌（Mtb的）的毒力因子。这两种效应蛋白，6-kDa早期分泌抗原靶标（ESAT-6）或EsxA和10-kDa培养滤液蛋白（CFP-10）或EsxB已通过各种实验设计和设置进行了测试（De Leon等，2012）。 ； Ma等人，2015； Peng等人，2016； Zhang等人，2016； Aguilera等人，2020； Ray等人，20 19 ）。EsxAB是一种异二聚体，与巨噬细胞的吞噬膜穿透有关，允许Mtb易位到细胞质中（De Leon等，2012; Ma等，2015; Zhang等，2016; Aguilera等。（2020年）。最近，我们已经确定了新的脂质成分的脂质体小号，大大提高了MPA的EsxA （雷等人，2019;巴斯克斯-雷耶斯等，2020）。在这里，我们用我们的新脂质组合物详细描述了基于荧光猝灭的脂质体泄漏测定法。