Low-efficiency (macro-)pinocytic internalization of non-pathogenic Escherichia coli into HEp-2 cells

HEp-2 cells internalize non-pathogenic Escherichia coli bacteria by a low-efficiency internalization mechanism which is upregulated in Pho-derepressed strains (as shown by Sinai and Bavoil in 1993), and is independent of microfilament integrity but requires functional microtubules. Here, we further characterize the microtubule requirement of this pathway using various effectors of microtubule integrity and function. Furthermore, we show that internalization is enhanced upon treatment with monodansylcadaverine, a specific inhibitor of receptor mediated endocytosis, and is insensitive to brefeldin A, which promotes the microtubule-dependent reorganization of the endosome. An assay system is also described to directly evaluate the contribution of pinocytosis to this pathway based on the ability of the bacteria to cointernalize and consequently colocalize with the fluid-phase marker, Texas-red-conjugated dextran (TRD). Using this assay, Hoescht-stained bacteria were observed in TRD-containing vesicles in numbers that are consistent with their observed internalization rate. Overall, these data are strongly supportive of the existence of a low-efficiency macropinocytic mechanism of entry for these non-pathogenic bacteria. Moreover, the observed requirements for host tyrosine kinase and protein kinase C activities suggest that it is inducible. Les cellules HEp-2 internalisent Escherichia coli non pathogéne par un mécanisme d'internalisation de faible efficacité, qui est accru chez les souches dont le régulon Pho est déréprimé (comme l'ont montré Sinai et Bavoil en 1993), et qui est indépendant de l'intégrité des microfilaments mais nécessite des microtubules fonctionnels. Nous poursuivons ici la caractérisation du rôle des microtubules dans cette voie d'entrée en utilisant des agents effecteurs de leur intégrité et de leur fonction. Nous démontrons que l'internalisation est augmentée grâce à un traitement par la monodansylcadavérine, un inhibiteur spécifique de l'endocytes par récepteur, et qu'elle n'est pas sensible à la bréfeldine A qui favorise la réorganisation de l'endosome dépendante des microtubules. Un essai est également décrit qui permet une évaluation directe de la contribution de la pinocytose dans cette voie d'entrée et qui repose sur la capacité des bactéries d'être co-internalisées avec le marqueur de phase fluide, le rouge Texas couplé au dextran (RTD). Ainsi, les bactéries révélées par le colorant de Hoescht sont observées dans des vésicules contenant aussi du RTD, et en nombre compatible avec le taux d'internalisation observé. Ces résultats sont en accord avec l'existence d'un mécanisme d'entrée de faible efficacité et à base macropinocytique pour ces bactéries non pathogénes. De plus, la nécessité des activités tyrosine kinase et protéine kinase C suggére que ce mécanisme est inductible.